胡馨月，吳永強，賴晉鋒，林莉，劉婭

（1.瀘州市疾病預防控制中心，四川瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，四川瀘州 646000）

氰化物是含氰基的一類化合物的總稱，是廣泛存在于自然界的劇毒物質(zhì)，可抑制組織細胞生物氧化酶活性，阻滯三羧酸循環(huán)，造成“細胞內(nèi)窒息”。生活中氰化物中毒以口服為主(如誤食含氰果仁）。GB 5009.36—2016 《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》中提及的定量檢測方法主要有分光光度法及氣相色譜法，但并未包含杏仁中的氰化物檢測。在食品監(jiān)測工作中，杏仁中氰化物的檢測一般采用氣相色譜法，但該方法精密度偏差過大且偏差方向難控，方法中因試劑等影響造成批次間電子俘獲（ECD）響應重復性差。目前連續(xù)流動儀測定氰化物的方法廣泛應用于職業(yè)衛(wèi)生檢測、環(huán)境檢測及食品檢測等眾多領(lǐng)域［1-4］。韋小燁等［5］建立的鮮木薯中氰化物的流動注射測定法線性范圍寬、重復性好，對于油脂含量較少的樣品，可以直接水解提取，取上清液過濾后進行分析。然而，對于含有大量油脂的樣品，如杏仁，如何在前處理過程中除去干擾，同時做到高回收率及高精密度等結(jié)果的測定方法尚未見報道。結(jié)合食品監(jiān)測方法及部分研究成果［6-8］，研究人員建立了連續(xù)流動分析儀測定氰化物的方法，杏仁樣品經(jīng)前處理后，儀器密閉蒸餾出氫氰酸，與氯胺T 反應生成氯化氰，以異煙酸-巴比妥酸作染料，代替異煙酸-吡唑啉酮規(guī)避苯甲醛與吡唑啉酮反應產(chǎn)生白色混濁的干擾［9-10］，生成物于600 nm處比色定量［11-13］。筆者建立連續(xù)流動分析法測定杏仁中的氰化物，采用正己烷萃取除去油脂，濾膜過濾除去固體顆粒，拓展了杏仁中氰化物檢測的方向。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

連續(xù)流動分析儀：SKALAR SAN5000 型，帶有四針自動進樣器及循環(huán)冷卻水系統(tǒng)，荷蘭SKALAR公司。

氣相色譜儀：安捷倫7890A，帶有CTC 頂空進樣器及ECD 檢測器，美國安捷倫科技公司。

超聲清洗儀；KQ2200DB 型數(shù)控，昆山超聲儀器有限公司。

電子分析天平：AL204-IC 型，感量為0.001 g，瑞士梅特勒-托利多公司。

低溫冷凍離心機；SIGMA2-16K 型，德國希格瑪公司。

氰化物標準溶液：50 mg／L，編號為GBW（E）080115，中國計量科學研究院。

水相針式濾器（聚醚砜）：13 mm×0.45 μm。

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氯胺T、1，3-二甲基巴比妥酸、異煙酸、正己烷：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

鹽酸：分析純，天津市大茂化學試劑廠。

月桂醇聚氧乙烯醚（Brij35）：CAS 號為9002-92-0，荷蘭SKALAR 公司。

實驗用水為超純水。

1.2 溶液配制

pH5.2 的緩沖溶液：稱取氫氧化鈉2.3 g 溶解于500 mL 超純水中，加入20.5 g 鄰苯二甲酸氫鉀，加超純水至975 mL 后，分別用1 mol／L 的鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至5.2，定容至1 L 后加入1 mL 月桂醇聚氧乙烯醚，充分溶解后過濾，于棕色瓶中冷藏，待用。

氯氨T 溶液：稱取氯胺T 2.0 g，用超純水定容至1 000 mL，過濾后使用。

顯色劑：稱取氫氧化鈉7 g 于約500 mL 超純水中，再加入1，3-二甲基巴比妥酸16.8 g、異煙酸13.6 g，加入970 mL 超純水溶解，用1 mol／L 的鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至5.2。

氰化物系列標準工作溶液：吸取2 mL 氰化物標準溶液于50 mL 容量瓶中，用超純水定容至標線，得2.0 mg／L 氰化物標準溶液，再分別吸取0、0.25、0.50、1.0、1.5、2.5、5.0、12.5 mL 上述2.0 mg／L氰化物標準溶液于比色管中，用超純水定容至25.0 mL，配制成氰化物質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.12、0.20、0.40、1.00、2.00 mg／L 的系列標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

低溫下準確稱取1.000 g（精確至0.001 g）已粉碎均勻的樣品于樣品管中，加入約40 mL 的超純水，立即蓋緊密封，超聲提取3 次，每次提取10 min，每次提取間隔為1 h，以防止其內(nèi)部液體溫度過高產(chǎn)生膨脹，繼而頂出密封蓋，從而造成樣品損失。于25～40 ℃放置48 h，使樣品充分水解（應充分振搖，使樣品無結(jié)塊，振搖時應按住樣品管蓋，防止樣品溢出），再把樣品管放入冰箱于4 ℃冷藏2 h后，以10 000 r／min 冷凍離心10 min，取出上清液，在樣品管中加入超純水10 mL，振搖，冷凍離心，將取出的上清液合并后，加入10 mL 正己烷，充分振搖，靜置分層后舍去正己烷，水層經(jīng)過0.45 μm 的水系過濾膜過濾，濾液定容至100 mL，加入氫氧化鈉0.2 g 使氫氧化鈉質(zhì)量濃度為2 g／L，冷藏，待混勻，待測。

1.4 加標樣品制備

稱取6 個均勻樣品1.000 g（精確至0.001 g）于樣品管中，分3 個批次加入50 mg／L 氰化物標準溶液0.2、0.7、1.0 mL，同1.3 方法進行處理，分別得到質(zhì)量濃度為0.1、0.35、0.5 mg／L 的加標樣品。

1.5 儀器工作條件

進樣時間：80 s；沖洗時間：90 s；探測峰起始值：0.01 AbS；峰形寬度：30%（5%～100%）；加熱器溫度：155、40 ℃；檢測波長：600 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 氫氧化鈉加入時機的優(yōu)化

氫氧化鈉的加入時機，分為在提取初和提取后加入。在提取初加入氫氧化鈉可以更好的保留樣品中氰化物的含量，但實際操作中，在提取初加入氫氧化鈉易致使樣品“膠質(zhì)化”嚴重，溶液不易經(jīng)0.45 μm 的水系過濾膜過濾，故選擇在低溫提取后加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。

2.2 萃取劑及其用量的選擇

2.2.1 萃取劑

對于油脂含量較低的樣品，可直接經(jīng)0.45 μm的水系過濾膜過濾測定，但杏仁中油脂含量高達50.33%［14］，易造成濾膜堵塞，不宜過濾。在了解杏仁中脂肪及蛋白質(zhì)的含量及特性［15］后，選擇易過濾樣品，經(jīng)正己烷處理后測定，結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。由表1 可知，樣品加標回收率為98.0%～104.7%，符合測定要求，正己烷對于測定結(jié)果并未產(chǎn)生偏差影響，因此選用正己烷為萃取劑。

表1 加入正己烷后樣品測定結(jié)果

2.2.2 正己烷用量

分別采用5、10、20 mL 正己烷完成萃取過程，所得試驗結(jié)果見表2。由表2 可知，樣品加標回收率為98.3%～97.3%，符合測定要求。經(jīng)t檢驗，在此樣本量下，分別加入5、10、20 mL 正己烷后，結(jié)果差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但在實際操作中，為保證油脂量高樣品的萃取效率，推薦加入10 mL 正己烷進行萃取。

表2 加入不同體積正己烷后樣品測定結(jié)果

2.3 樣品放置時間及溫度選擇

參照食品風險監(jiān)測中氣相色譜法的前處理條件，為了使樣品能夠水解地更加充分，將樣品于25～40 ℃條件下放置48 h 密封水解，樣品充分水解后，放至冰箱冷藏2 h 再離心，可使樣品更好地脂水分離，且提高了正己烷的萃取效果，因此樣品水解溫度為25～40 ℃，放置時間為48 h。

2.4 線性方程與檢出限

2.4.1 線性方程

在1.5 儀器工作條件下測定氰化物系列標準工作溶液，以氰化物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標繪制標準工作曲線，若取0～2.00 mg／L濃度區(qū)間，線性方程為y=0.000 64x+0.002 36，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 4；若取0～1.00 mg／L 濃度區(qū)間，線性方程為y=0.000 66x-0.000 55，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 9。比較發(fā)現(xiàn)，濃度過高易造成峰與峰之間的距離過小，峰面積疊加掩蓋，導致曲線r值降低，因此連續(xù)流動分析法測定氰化物標準工作曲線的線性范圍為0～1.0 mg／L，超出范圍的樣品需稀釋后進行測定。

2.4.2 檢出限

采用連續(xù)流動分析法測定空白樣品11 次，若杏仁取樣為1.000 g，定容100 mL 時，用2.764 倍標準差計算檢出限，檢出限為0.05 mg／kg，定量限為0.15 mg／kg。

2.5 回收率與精密度

在已知含量的樣品溶液中加入1.4 中低、中、高濃度的加標樣品溶液，在1.5 儀器工作條件下重復測定6 次，試驗結(jié)果見表3。由表3 可知，平均回收率為98.0%～104.7%，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.56%～1.34%，表明該方法具有較高的準確度和精密度，滿足檢測要求。

表3 加標回收率和精密度試驗結(jié)果

2.6 比對試驗

連續(xù)流動分析方法與氣相色譜法從以下幾個方面進行比對：

（1）開機穩(wěn)定時間、樣品用量及穩(wěn)定性。連續(xù)流動分析儀開機到穩(wěn)定耗時較短，從進樣蒸餾到測定僅需約0.5 h，全程密閉蒸餾加試劑，連續(xù)進樣后，每個樣品分析時間約為2 min，每次進樣為2 mL，在分析過程中序列可以連續(xù)加入后續(xù)樣品。氣相色譜儀穩(wěn)定耗時較連續(xù)流動分析儀長，每個樣品分析時間約為10 min，每次進樣為10 mL，且在現(xiàn)階段技術(shù)條件下，樣品序列編輯運行后不能隨時加入后續(xù)樣品，需重新編輯序列及測定標準。樣品量少時，二者耗時區(qū)別不大，隨著樣品量增加，連續(xù)流動法測定耗時明顯較氣相色譜法短。連續(xù)流動法在樣品提取后加入了氫氧化鈉以保留氰基，使樣品中被測物質(zhì)在水中穩(wěn)定性增加，因此從耗時耗量及樣品穩(wěn)定性上看，連續(xù)流動法優(yōu)于氣相色譜法。

（2）線性范圍。連續(xù)流動法測定過程中氰化物濃度過高易造成峰過大，峰間距過小，峰面積疊加掩蓋，從而導致測定值準確度低，因此連續(xù)流動分析法測定氰化物的質(zhì)量濃度應在0～1.0 mg／L 范圍內(nèi)，超出線性范圍的樣品需稀釋后測定。氣相色譜法的線性范圍超過1.0 mg／L 后，相關(guān)系數(shù)降低，在0～1.0 mg／L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，連續(xù)流動法的r值為0.999 9，優(yōu)于氣相色譜法r值（0.998 6），因此在此濃度范圍內(nèi)連續(xù)流動法優(yōu)于氣相色譜法。

（3）檢出限。氣相色譜ECD 檢測器對氰基響應靈敏度高，檢出限較連續(xù)流動法低。雖氣相色譜法檢出限優(yōu)于連續(xù)流動法，但兩法檢出限均能滿足檢測要求。

（4）回收率。兩種方法的回收率均能滿足檢測要求，但氣相色譜法回收率跨度遠大于連續(xù)流動分析法，且方法的不可控因素更多(如氯胺T)，因此，在0～1.0 mg／L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)連續(xù)流動法回收率要優(yōu)于氣相色譜法。

（5）精密度。在0～1.0 mg／L 濃度范圍內(nèi)，對兩種方法的檢測結(jié)果進行用F檢驗，低、中、高濃度組的F值均大于F值表中F(5，5)=5.05，即連續(xù)流動分析法的精密度優(yōu)于氣相色譜法。

連續(xù)流動分析法與氣相色譜法比對結(jié)果如表4所示。

表4 比對試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了連續(xù)流動分析法測定杏仁中的氰化物。樣品超聲過程應密封且時間不能連續(xù)過長，以防止樣品過熱造成噴濺；樣品水解后離心冷藏（4～8 ℃）時間應在30 min 以上，利于油脂分離；樣品經(jīng)正己烷萃取，并在濾液中加入氫氧化鈉，以增加氰化物在水溶液中的穩(wěn)定性；試劑在測定過程中均在較密閉空間內(nèi)。連續(xù)流動分析的精密度、加標回收率等較氣相色譜法的誤差小，雖檢出限較氣相色譜法略高，但在實際工作中能滿足檢測要求，因此連續(xù)流動儀測定杏仁中氰化物的方法整體優(yōu)于氣相色譜法，其在線分析時間更短，穩(wěn)定性及安全性更好，適于推廣應用。