胡凌威 孫長森 董迎輝 林志華

(1. 浙江萬里學院生物與環(huán)境學院 寧波 315100; 2. 浙江萬里學院 浙江省水產(chǎn)種質資源高效利用技術研究重點實驗室寧波 315100; 3. 浙江萬里學院寧海海洋生物種業(yè)研究院 寧海 315604)

溫度是影響貝類生長發(fā)育重要的環(huán)境因子(許友卿等, 2012)。近年來, 在貝類養(yǎng)殖過程中因夏季高溫誘發(fā)的大規(guī)模死亡現(xiàn)象越來越普遍, 高溫適應或耐受能力已成為貝類遺傳改良的重要育種目標性狀(王慶志等, 2014; 王金鵬, 2016; 邢強, 2016; 陳楠,2016)。目前用來衡量貝類高溫耐受能力的方法通常是在一定高溫水平下存活或死亡情況來評定(Pernetet al, 2007; Kvingedalet al, 2010), 操作方法簡單易行,但因顧忌過高溫度會對貝類產(chǎn)生不可恢復的影響,因此這種方法在貝類耐高溫新品種選育中總體實施效果一般。也有研究者通過酶活(Chappleet al, 1998;Hamdounet al, 2003)、脂質動力學和生理反應(Parket al, 2007)以及熱休克蛋白表達(Widdows, 1973;Nickersonet al, 1989)來研究貝類對高溫的生理響應,這些方法費時費力, 且需要殺死貝類個體本身, 在貝類普遍缺乏穩(wěn)定近交系的情況下無法在貝類育種實踐中應用。

眾所周知, 貝類心臟跳動的頻率與振幅和機體血液循環(huán)量有直接關系, 心臟跳動強, 頻率快, 血液的循環(huán)量大, 新陳代謝旺盛(Depledgeet al, 1990)。已有研究表明, 無脊椎動物的心率可以通過捕獲紅外信號的方法被準確測得, 該方法高效穩(wěn)定, 且對貝類生物體無損傷。根據(jù)阿倫尼烏斯方程(Arrhenius 方程),在一定溫度范圍內隨著溫度的上升, 新陳代謝加快,心率加快; 當溫度超過其耐受范圍, 則隨著溫度的上升, 心率減慢, 這個拐點溫度稱為阿倫尼烏斯拐點溫度(Arrhenius break temperatures, ABT) (Bakhmetet al,2009)。目前, 心率ABT 已成為貝類耐溫性狀的重要評測指標, 在帽貝(Donget al, 2015)、扇貝(Xinget al,2016, 2019)、鮑(Chenet al, 2016)等貝類耐溫能力評價和遺傳改良中實現(xiàn)了初步應用。

縊蟶(Sinonovacula constricta)是我國四大傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一(董迎輝等, 2012), 2019 年養(yǎng)殖產(chǎn)量達86.9 萬t, 產(chǎn)值超過200 億元, 具有重要的經(jīng)濟價值(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等, 2020)。近年來, 受全球氣候變暖的影響, 夏季極端高溫水平一再被突破,且高溫持續(xù)時間有延長的趨勢, 以致灘涂和池塘養(yǎng)殖區(qū)縊蟶死亡情況不斷加重, 給縊蟶養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了嚴重威脅。因此, 建立縊蟶穩(wěn)定、無損傷的耐高溫測評技術指標應用于耐高溫性狀的遺傳改良和新品種培育變得尤為迫切。本研究擬建立基于生物心跳參數(shù)紅外監(jiān)測的縊蟶心率測評方法, 分析縊蟶不同個體間心率的變異情況, 以及隨溫度變化的規(guī)律, 計算獲得縊蟶個體高溫耐受力指標ABT, 進一步分析心率ABT 與生長性狀的關系, 為縊蟶耐高溫新品種的選育提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用材料為縊蟶(Sinonovacula constricta)“甬樂1 號”新品種14 月齡貝, 平均殼長(53.56±3.78) mm,活體取自浙江萬里學院貝類育種咸祥試驗基地, 清洗干凈并剔除破損個體后運回實驗室, 在5 個規(guī)格為60 cm×50 cm×40 cm 循環(huán)水養(yǎng)殖箱內進行暫養(yǎng), 控制的暫養(yǎng)條件為: 海水鹽度20、溫度20 °C、pH 8.0 左右, 連續(xù)通氣。暫養(yǎng)過程中及時剔除死亡和活力不佳的縊蟶個體, 每天保障全換水1 次, 定時投喂餌料2次, 經(jīng)7 d 暫養(yǎng)后選用殼體無損傷、活力良好的縊蟶個體用于后續(xù)心跳測定實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 縊蟶心跳監(jiān)測設備及連接 心跳監(jiān)測設備主要部件包括紅外傳感器Infrared Sensors (CNY-70)和心跳信號放大器 Heartbeat Monitor Amplifier(AMP-03U) (購自葡萄牙Newshift?公司)、PowerLab 8/35 八通道研究型高速記錄主機(含LabChart Pro 專業(yè)版, 澳大利亞ADInstruments 生產(chǎn), 購自埃德儀器國際貿(mào)易(上海)有限公司)、藍丁膠(Blu-tag) (購自澳大利亞BOSTIK 公司)。紅外傳感器探頭一端用藍丁膠固定在縊蟶心臟對應的殼表面, 另一端以RJ11 連接方式接入信號放大器, 信號放大器和 PowerLab 8/35 八通道研究型高速記錄主機兩端均以BNC 連接方式相互連接, PowerLab 8/35 八通道研究型高速記錄主機以 USB 連接方式接入電腦, 利用內置軟件(LabChart Version 8.0)獲取心跳的有關參數(shù)。

1.2.2 升溫控溫裝置和心跳參數(shù)測定 升溫設備為HWS-28 電熱恒溫水浴鍋(購自上海一恒科學儀器有限公司, 分辨率為 0.1 °C)。水浴鍋內放置一個40 cm×25 cm×10 cm 玻璃水族箱, 水族箱內注入鹽度20 的海水(液面高度6 cm 左右), 水浴鍋內注入純水高度8 cm 左右。

每次實驗隨機選取8 只生長狀況良好的縊蟶, 在每個個體心臟殼表位置用藍丁膠固定到紅外傳感器探頭上, 一起放入上述的玻璃水族箱后連續(xù)充氣, 待每只縊蟶的水管和斧足充分舒展后開始升溫, 升溫區(qū)間為 22—38 °C, 每次升溫 1 °C, 待溫度穩(wěn)定10 min 后記錄該水溫條件下典型波形圖和心率參數(shù),爾后再進行后續(xù)升溫以及波形圖、心率數(shù)據(jù)采集。前后共進行12 次實驗, 對96 只縊蟶在不同溫度下的心跳的波形圖和心跳數(shù)據(jù)進行了采集, 每次實驗前還對每只縊蟶的生長性狀測定, 包括殼長(mm)、殼高(mm)、殼寬(mm)、活體重(g)等。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將每只縊蟶個體心率數(shù)據(jù)轉化為以自然數(shù)為底的對數(shù), 同時將溫度轉化為1000/K(絕對溫度)的形式。然后在阿倫尼烏斯方程Arrhenius 曲線上推測拐點的兩側, 將心率與溫度數(shù)據(jù)進行線性擬合, 兩個方程交點的橫坐標對應的溫度即為該縊蟶個體的ABT值(Bakhmetet al, 2009; 陳楠, 2016)。

利用Excel 2016 軟件對不同溫度水平下96 個縊蟶個體的心率數(shù)據(jù)進行最大值、最小值、平均數(shù)、標準差和變異系數(shù)等有關特征值進行計算, 分析心率隨溫度變化的動態(tài)規(guī)律以及個體間的變異; 利用SPSS22.0 對縊蟶心率ABT 數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗, 計算其與生長性狀的相關系數(shù), 并采用逐步回歸和通徑分析方法對縊蟶心率ABT 受其殼長、殼高、殼寬和活體重等生長性狀影響情況進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下縊蟶心跳監(jiān)測的波形特征

圖1 為一只縊蟶個體在22、27、32、35、38 °C等五個不同水溫條件下心跳監(jiān)測獲得的波形譜。從圖1 可以看出, 22 °C 時, 縊蟶心臟搏動規(guī)律, 周期明顯,圖中縊蟶個體的心率為21.15 BMP; 當溫度升至27、32 °C 時, 縊蟶心跳隨著溫度升高不斷加快, 但心臟搏動仍表現(xiàn)正常, 周期穩(wěn)定, 兩個溫度條件下縊蟶個體的心率為24.12 BMP; 當溫度達到35、38 °C 時, 縊蟶心跳隨著溫度升高不斷減慢, 且心臟搏動很難維持在穩(wěn)定水平, 周期時不時發(fā)生了波動。從波形曲線可以看出, 縊蟶心跳可以分為兩種波形, 一種是窄而高、單一峰的心室波形, 另一種為寬而低、連續(xù)的心耳波形, 縊蟶一個心跳周期由一次心室的收縮和連續(xù)兩次心耳的收縮所構成。

圖1 縊蟶心跳波形與溫度關系圖Fig.1 Relationship between heartbeat waveform and temperature in S. constricta

2.2 縊蟶心率變異及ABT 估算

升溫過程中96 只縊蟶個體心率變異的特征值見表1。由表1 數(shù)據(jù)可知, 在升溫前期縊蟶心跳隨著溫度的升高而逐漸變快, 到后期縊蟶心跳隨著溫度的升高而逐漸減弱, 96 個個體22 °C 時心率平均值為19.66 BMP, 而后隨溫度上升心率值逐漸變大, 31 °C時平均心率達峰值為33.66 BMP, 在32 °C 以后心率平均值開始下降, 34 °C 監(jiān)測到穩(wěn)定心率的平均值為29.19 BMP, 35 °C 以后心跳進一步變慢且難以穩(wěn)定。同時我們也觀察到縊蟶心率在個體之間的變異非常大, 如在22、34 °C 時, 心率的變幅分別為13.90—27.95 BMP、19.18—35.81 BMP, 變異系數(shù)分別達14.06%和13.18%, 只有在26—31 °C 溫度范圍內, 變異系數(shù)在10%以下, 但也均超過了8.5%。

依據(jù)阿倫尼烏斯方程(Arrhenius 方程), 對溫度和心率進行數(shù)據(jù)轉換后, 以心率出現(xiàn)拐點前后的數(shù)據(jù)分別擬合ln(BMP)依1000/K兩個線性回歸方程, 它們的交點所對應的溫度即為縊蟶心率的ABT, 如圖2 所示。通過計算分別獲得96 只縊蟶個體心率ABT, 最小值為 29.74 °C, 最大值為 31.86 °C, 平均值為31.02 °C。

圖2 縊蟶12 號個體ABT 指標估算的示意圖Fig.2 Diagram of ABT estimation for the individual No.12 of S.constricta

2.3 縊蟶心率ABT 與生長性狀的相關和回歸分析

觀察變量分布的正態(tài)性是進行統(tǒng)計分析的前提,以往的研究表明貝類殼長、殼高、殼寬和活體重等生長性狀數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計分析的這一要求。本研究對96個縊蟶個體的心率ABT 數(shù)值進行頻率分布、正態(tài)性趨勢進行分析, 結果見圖3。從圖3 結果可以看出, 縊蟶的心率 ABT 也比較符合正態(tài)分布, 進一步采用Kolmogorov-Smirnova 方法進行統(tǒng)計測驗, 其P值為0.200 (>0.05), 表明該類數(shù)據(jù)也符合正態(tài)分布。

圖3 縊蟶心率ABT 數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性檢測Fig.3 Normality detection of ABT data distribution of heart rate in S. constricta

縊蟶心率ABT 與生長性狀的相關系數(shù)見表2, 從表中結果可以看出, 縊蟶心率ABT 與殼長、殼高、活體重等3 個生長性狀具有不同程度的正相關關系,其中與殼長的相關系數(shù)達到0.423 6, 顯示為極顯著的正相關, 而與殼寬性狀呈負相關關系, 相關系數(shù)為–0.321 9, 同樣達到了極顯著性水平。

表2 縊蟶心率ABT 指標與生長性狀的相關系數(shù)Tab.2 The related coefficient between heat rate ABT and growth traits of S. constricta

采用逐步回歸統(tǒng)計分析方法, 建立了縊蟶心率依據(jù)生長性狀變化的最優(yōu)回歸方程:

Y= 29.777 + 0.042X1+ 0.104X2–0.209X3,R2=0.453,F=11.847**, (1)

該方程表明, 在4 個生長性狀中, 活體重對縊蟶心率ABT 沒有顯著影響, 在回歸分析中被剔除; 殼長、寬高、殼高等3 個體尺性狀對縊蟶心率ABT 的變化具有不同程度的影響, 回歸關系達到了極顯著水平(F=11.847**), 其中殼長每增加1 個單位, 心率ABT 增加0.042 個單位, 殼高每增加一個單位, 心率ABT 增加0.104 個單位, 而殼寬每增加一個單位, 縊蟶心率ABT 減少0.209 個單位?；貧w方程的決定系數(shù)R2=0.453, 說明縊蟶心率ABT 除了受體尺性狀的影響, 可能還受到遺傳等其他因素的影響。

2.4 縊蟶心率ABT 與體尺性狀間的通徑分析

由SPSS 22.0 計算得到縊蟶殼長、殼高、殼寬等3 個體尺性狀對心率ABT 的直接通徑系數(shù)分別為0.395 9、0.389 3 和–0.689 5, 由于3 個體尺性狀彼此相關, 因此某一體尺性狀還通過另外兩個體尺性狀間接影響縊蟶心率ABT, 它們對心率ABT 作用的通徑關系見圖4。

圖4 縊蟶體尺性狀與心率ABT 通徑關系圖Fig.4 The path relationship between body size and heart rate ABT of S. constricta

進一步計算并整理間接通徑分析的結果列于表3中, 從表3 數(shù)據(jù)可知縊蟶3 個體尺性狀中對心率ABT總的影響中, 殼長最大, 其次為殼寬(總的相關系數(shù)為0.423 6、–0.321 9), 而直接影響中, 殼寬的直接作用最大, 直接通徑系數(shù)為–0.689 5, 然后是殼長、殼高,直接通徑系數(shù)分別為0.395 9 和0.389 3。殼高性狀通過殼寬性狀來影響心率ABT 的作用最大, 間接通徑系數(shù)為–0.453 6, 其次是殼寬通過殼高性狀對心率ABT 變化影響, 間接通徑系數(shù)為0.256 1, 而殼長和殼寬性狀通過彼此作用, 進而影響心率ABT 的變化最弱, 間接通徑系數(shù)分別為–0.194 1 和0.111 4。

表3 縊蟶體尺性狀對心率ABT 影響的通徑分析Tab.3 The path analysis between heart rate ABT and body size of S. constricta

3 討論

3.1 貝類抗逆性狀傳統(tǒng)測評方法及其不足

貝類養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中, 因自然條件變化或人為因素影響常常受到許多不良生存環(huán)境的脅迫, 如高溫、低氧、高氨氮等, 給貝類養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定增產(chǎn)帶來了嚴重威脅。因此, 近年來貝類育種從早期單純關注生長性狀的遺傳改良逐步轉變?yōu)楦幼⒅乜鼓嫘阅芴嵘乃悸飞蟻? 在這樣的背景下促進了貝類有關抗逆性狀評測方法的研究。然而, 目前貝類抗逆性狀的評估指標仍然更多地集中于死亡率(Wrightet al, 1993; Lainget al, 1996; Comptonet al, 2007)、酶活力(Anet al, 2010;Kvingedalet al, 2010)、基因表達(Chappleet al, 1998;Hamdounet al, 2003; Parket al, 2007)等, 這些方法多需要犧牲貝類活體樣本, 且費時費力, 較難在獲取抗逆性評價的同時留取性能優(yōu)良的貝類個體, 大大降低了貝類抗逆材料積累和新品種選育的效率。

3.2 心跳參數(shù)在貝類抗逆性狀定量測評中應用與實踐

心跳參數(shù)的無損傷測定方法由Depledge 等(1990)發(fā)明, 而后經(jīng)Chelazzi 等(1999)改進, 逐步應用到了貝類抗逆性能分析中。Curtis 等(2000)研究了銅離子脅迫條件下紫貽貝心跳參數(shù)的變化規(guī)律, Bakhmet 等(2005, 2009)分析了紫貽貝在鹽度變化、油污污染等脅迫條件下心率變化的動態(tài)特征, Dong 等(2011)研究了帽貝心跳參數(shù)對溫度變化的響應, 這些研究工作均表明心跳參數(shù)可以在不損傷貝類的情況下較好地指示個體的活力水平, 對貝類抗逆性狀是一種比較有效和可靠的評價指標。近年來, 國內學者將心跳參數(shù)應用到扇貝(Xinget al, 2016, 2019)、鮑(林思恒等,2016; Chenet al, 2016)等重要養(yǎng)殖貝類抗逆性狀評價和遺傳改良工作中, 推動和引領了我國貝類育種技術的發(fā)展。

3.3 縊蟶心跳參數(shù)對溫度的響應

縊蟶心跳參數(shù)的動態(tài)特征和變異規(guī)律研究結果表明, 22—34 °C 范圍內可采集獲得縊蟶心臟搏動的穩(wěn)定波形, 心率總體上隨溫度上升呈現(xiàn)規(guī)律性變化,表現(xiàn)為在一定的溫度閾值水平以下縊蟶心率隨溫度的上升而增大, 超過一定的溫度閾值即隨溫度的上升而減少, 平均心率31 °C 達峰值為33.66 BMP。不同縊蟶個體之間的心率差異明顯, 22 °C 時心率最小值為13.90 BMP, 最大值為27.95 BMP, 平均心率為19.66 BMP, 差異水平最高, 變異系數(shù)達14.06%, 26—31 °C的中間溫度個體間的心率差異相對較小, 但變異系數(shù)也均在8.5%以上; 用阿倫尼烏斯方程可以很好地實現(xiàn)線性擬合并求得每個縊蟶個體的心率ABT, 所有縊蟶個體中心率ABT 最小值為29.74 °C, 最大值為31.86 °C, 平均值為31.02 °C。

3.4 縊蟶耐高溫品種選育的策略

在我國, 縊蟶是浙江、福建等南方沿海省份重要的經(jīng)濟貝類, 養(yǎng)殖過程中大多要經(jīng)歷夏季高溫的考驗。據(jù)了解, 縊蟶的養(yǎng)殖成活率普遍不足50%, 其死亡和淘汰主要集中在夏季高溫一兩個月內。因此, 將心跳參數(shù)引入縊蟶溫度適應性狀定量評價, 并據(jù)之開展耐高溫育種材料篩選和新品種培育非常迫切。在縊蟶耐高溫性狀的遺傳改良過程中, 心率ABT 可以作為該性狀的評測指標, ABT 值高的個體、家系或種群應加以優(yōu)先保存和利用。本文還研究了縊蟶心率ABT 與殼長、殼高、殼寬和活體重的相關關系, 建立了心率ABT 受生長性狀影響的最優(yōu)回歸方程, 并進行了通徑分析, 結果顯示縊蟶殼長對心率ABT 的總體影響最大, 而殼寬直接的負作用最強, 在縊蟶耐高溫新品種選育的過程可以同時關注殼形的選擇, 相對扁長的縊蟶個體可能具有更好的耐高溫潛力。

4 結論

本文將生物心跳參數(shù)紅外監(jiān)測技術應用于縊蟶溫度耐受性狀定量測定研究, 結果顯示在22—34 °C范圍內可以獲得縊蟶心跳的穩(wěn)定波形, 且符合在升溫前期隨溫度升高心跳加快(心率值變大), 達到一定溫度后隨溫度上升心跳減慢(心率值減少)的特征, 適合運用阿倫尼烏斯方程進行線性擬合求取心率ABT。進一步統(tǒng)計分析表明, 心率ABT 在不同縊蟶個體間變異明顯, 是其溫度耐受性狀一種理想的測評指標,可在縊蟶耐高溫新品培育過程中加以利用。同時, 縊蟶心率ABT 也不同程度地受到其殼長、殼寬等體尺性狀的影響, 在縊蟶耐高溫性狀的遺傳改良中可兼顧殼形的選擇以提高育種的效率。