李 肸，張曉華,2,3，于 敏,2,3**

(1.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266237；3.中國海洋大學深海圈層與地球系統(tǒng)前沿科學中心，山東 青島 266100)

微塑料是指粒徑小于5 mm的塑料碎片，廣泛存在于海洋環(huán)境中[1-3]。微塑料占塑料垃圾的92.4 %[4]，主要包括以下幾種類型：如聚乙烯(Polyethylene,PE)、聚丙烯(Polypropylene，PP)、聚苯乙烯(Polystyrene，PS)和聚氯乙烯(Polyvinylchloride，PVC)等[3,5-6]。2017年全球的塑料生產已達到3.5億t，并且在逐年增加[7]。每年約有4×106～1.2×107t的塑料進入海洋，據(jù)估計到2050年海洋中的微塑料數(shù)量將超過魚類數(shù)量[6]。另外，持久性塑料短期內可以降解為微塑料和納米塑料并長期存在于海洋環(huán)境中[8]，對海洋生態(tài)環(huán)境造成嚴重影響。近海受人類活動影響較大，漁業(yè)、航運、沿海工業(yè)、污水處理廠等領域是沿海微塑料入海的主要源頭[9]，且微塑料的豐度與人口密度之間存在顯著相關性[10]。因此，近海也是微塑料污染較為嚴重的海域。已有研究發(fā)現(xiàn)，PE和PP是近海海水和沉積物中存在的主要微塑料類型[11]。這兩種微塑料難以降解并在海洋環(huán)境中大量積累，造成嚴重的海洋生態(tài)問題。因此，本實驗選擇PP微塑料作為唯一碳源，對青島近海微生物進行富集培養(yǎng)、多樣性分析及PP降解菌的篩選。

塑料的降解可分為非生物降解和生物降解。非生物降解包括物理降解、光降解和化學降解。非生物降解可以改變聚合物的性質并產生脆化，將塑料降解為微塑料甚至更小粒徑的納米塑料，降解過程非常緩慢[12]。在生物降解塑料的過程中，聚合物由于過大不能滲透進微生物的細胞膜，因此生物降解的第一步是在微生物胞外酶的作用下裂解聚合物的側鏈或主鏈從而形成較小的聚合物單元(如低聚物、單體)，微生物可以吸附在這些小分子上并對其進行降解[13]。生物降解是目前最經濟環(huán)保高效的一種微塑料處理措施。微塑料作為一種新型的海洋基質，水生微生物定植其上并進行傳播，這些附著微生物可能對降解微塑料有一定的貢獻[7,14-16]。已有研究報道，變形菌門、擬桿菌門和放線菌門細菌是微塑料附著細菌群落的主要優(yōu)勢類群[17]，且其多樣性與暴露時間、地理位置和微塑料類型有關[2,18]。不同微塑料類型上定植的細菌群落與微塑料基質表面的疏水性質有關[19]。以PP微塑料為唯一碳源富集培養(yǎng)微塑料降解細菌，目前發(fā)現(xiàn)降解PP能力較強的細菌主要包括γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)的假單胞菌屬(Pseudomonas)[20-21]和弧菌屬(Vibrio)[20]，厚壁菌門(Firmicutes)的芽孢桿菌屬(Bacillus)[21-23]和放線菌綱(Actinobacteria)的紅球菌屬(Rhodococcus)[23]等。近年來，已有諸多研究關注微塑料附著細菌的群落多樣性及微塑料降解菌的功能活性，如Xu等[2]通過16S rRNA基因高通量測序技術，分析了有限時間內中國近海原位海水中微塑料表面細菌群落的多樣性，也有研究分析了芽孢桿菌屬和紅球菌屬等細菌對微塑料的降解活性[22-23]，但通過富集培養(yǎng)篩選獲得微塑料降解細菌的相關研究較少，關于微塑料的生物降解機制仍然沒有定論[22]。目前對微塑料生物降解過程的認識大多基于實驗室研究，且通常集中于微塑料單一降解機制的研究，在若干降解機制同時發(fā)生的環(huán)境中微塑料降解相關的研究十分有限[24]。另外，關于微塑料的降解多集中于研究其物理及化學性質的變化，在分子水平上對細菌裂解塑料聚合物的過程仍然是未知的[25]。

本研究通過16S rRNA基因高通量測序技術對青島近海微生物隨富集時間的不同在PP顆粒上的群落演替進行了分析，并對富集40 d后的PP附著細菌進行了分離純化及鑒定，進一步對獲得菌株的PP降解能力進行了檢測。本研究旨在揭示以PP微塑料為唯一碳源的富集過程中微生物的群落演替，并結合分離培養(yǎng)獲得PP降解能力較強的細菌，為緩解微塑料對海洋生態(tài)系統(tǒng)的污染提供潛在降解菌資源。

1 材料和方法

1.1 聚丙烯微塑料

本研究所用聚丙烯(Polypropylene，PP)微塑料為白色球狀，直徑為4～5 mm，在25 ℃密度為0.9 g/mL。由Sigma Aldrich Chemical Co.(USA)生產(見圖1A)。

1.2 采集樣品收集與處理

本研究于2019年7月在青島棧橋(Zhanqiao,ZQ)采集的沉積物及在第三海水浴場(The third bathing beath，SY)采集的海水樣品用于富集培養(yǎng)。采集樣品用無菌離心管收集，置于冰上隨后帶回實驗室進行富集培養(yǎng)。具體的站位信息見圖1B。

(ZQ：棧橋；SY：第三海水浴場。A.PP微塑料顆粒；B.采樣圖。ZQ:Zhanqiao;SY:The third bathing beach.A.Polypropylene microplastic particles;B.Location of the sample.)圖1 PP微塑料顆粒及采樣站位圖Fig.1 Polypropylene microplastic particles and location of the sample

1.3 培養(yǎng)基

富集所用培養(yǎng)基為以PP顆粒為唯一碳源的礦物鹽培養(yǎng)基(Mineral salt medium，MSM)培養(yǎng)基[26]。將MgSO40.2 g，CaCl20.02 g，KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，F(xiàn)eCl30.05 g溶于1 L三蒸水中。用NaOH將培養(yǎng)基pH調至7.0，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后添加經紫外滅菌后的0.5 g/L PP于培養(yǎng)基。

采用改良的NA培養(yǎng)基[27]對附著在PP上的細菌進行分離純化。將胰蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化鈉5 g溶于1 L 海水中。用NaOH將培養(yǎng)基pH調為7.3左右。121 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基添加20 g/L的瓊脂。

1.4 富集培養(yǎng)

將棧橋采集的沉積物樣品(0.5 g樣品與50 mL的0.85%無菌生理鹽水與混勻)，第三海水浴場采集的海水以1%接種量接種于以PP為唯一碳源的600 mL MSM培養(yǎng)基。分設0、7、21、40和60 d 5個時間段，每個時間段各3個平行。以未接種含PP為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基作為對照。對照組與實驗組均放置在室溫下靜置培養(yǎng)。

1.4.1 富集水樣及PP顆粒的收集 每個時間段取400 mL 富集培養(yǎng)物進行0.22 μm濾膜(直徑為47 mm)過濾，濾膜收集在2 mL無菌保種管中，液氮速凍，隨后保存在-80 ℃冰箱；同時收集全部的PP顆粒，與濾膜處理相同。

1.4.2 菌株的分離純化與保藏 收集富集培養(yǎng)40 d后的PP顆粒。將微塑料顆粒置于無菌生理鹽水中渦旋振蕩3 min，隨后將PP顆粒振蕩后的生理鹽水涂布于NA培養(yǎng)基，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌落后，按照菌落大小、形態(tài)、顏色等特征挑取單菌落，純化3次后獲得純菌株。純菌株接種于NA斜面，用15%的甘油保種液(15%甘油：85%的生理鹽水，V:V)進行保種并置于-80 ℃冰箱低溫保存。

1.4.3 細菌基因組DNA的提取、16S rRNA基因序列擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用煮沸法或酚-氯仿抽提法[28]提取菌株的基因組。采用細菌通用引物27F[29](5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1490R[29](GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)、PCR擴增體系[30]、酶切體系[30]對16S rRNA基因進行擴增及酶切。酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后挑選條帶不同的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。采 用 Chromas 軟件分析測序所得的16S rRNA 基因序列，去除低質量的測序堿基后得到的有效序列長度約1 400 bp，將序列提交至EZbiocloud (https://www.ezbiocloud.net/)數(shù)據(jù)庫進行序列比對，以16S rRNA基因序列相似性大于等于98.65%作為同種菌株的劃分標準[31]。將目的序列與近緣菌株的16S rRNA基因序列用MEGA 7.0 軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000 次自展(Bootstrap)評估系統(tǒng)發(fā)育樹的準確性。

1.4.4 PP降解活性檢測 將從富集培養(yǎng)40 d的PP樣品上分離得到的細菌進行PP降解活性檢測。將細菌接種到新鮮的NA培養(yǎng)基，活化后轉接到NB培養(yǎng)基，待菌株長到對數(shù)期(OD600為0.4)后以1%及10 %的接種量接種到以PP為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中。每50 mL MSM培養(yǎng)基含0.1 g的PP微塑料。室溫培養(yǎng)4周。以不接菌含PP為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基為對照。每個菌株設置3個平行。

1.4.5 PP降解率計算 將培養(yǎng)前處理過的微塑料稱重并記錄，記為W0。將放置在室溫培養(yǎng)4周的微塑料過濾回收后，采用70 %乙醇進行四階段清洗(每個階段孵育2 min后震蕩2 min，重復4次)。清洗后放入50 ℃烘箱中過夜干燥后稱重，記為W1。計算公式如下：

1.5 掃描電鏡觀察

用無菌蒸餾水沖洗棧橋泥樣富集40 d后的PP顆粒，以洗去多余的培養(yǎng)基并干燥，以未接菌的PP顆粒作為對照。掃描電鏡在0.3 MPa氬氣環(huán)境，25 mA電流下在塑料球表面噴金后進行觀察。

1.6 富集樣品DNA的提取及16S rRNA基因高通量測序

采用Power Soil DNA Isolation Kit(MO BIO)試劑盒對每個時間段富集的水樣濾膜和PP顆粒上的DNA進行提取。采用NanoDrop ND 2000紫外分光光度計以及瓊脂糖電泳檢測DNA樣品的純度與濃度。采用微生物通用引物515FmodF,806RmodR進行PCR擴增，檢測合格后使用Illumina Miseq平臺測序。測序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

樣品采用“站位+W/P_富集天數(shù)”進行命名，其中W為富集水樣，P為富集微塑料樣品。如SW_0d，SP_0d。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用FLASH軟件[32]對原始reads進行質控，按照97%相似性使用UPARSE軟件[33]對非重復序列進行OTU聚類，獲得OTU代表序列，采用Silva數(shù)據(jù)庫對OTU進行注釋，最終生成OTU表格。將得到的OTU表按照樣品的最小序列數(shù)對OTU表進行抽平。在97%的相似度水平上對注釋得到的總細菌OTU進行Alpha和Beta多樣性分析。Alpha多樣性分析主要采用mothur[34]計算Ace指數(shù)、Chao I指數(shù)、Simpson指數(shù)、shannon指數(shù)、Coverage指數(shù)等；Beta多樣性分析通過采用NMDS分析，即非度量多維尺度分析(Non-metric multidimensional scaling)以研究樣本群落的相似性或差異性。使用PRIMER6軟件中的ANOSIM單因子分析進行組間差異檢驗。Alpha多樣性指數(shù)在富集水體樣品和微塑料樣品之間的差異顯著性檢驗由t檢驗-平均值的成對二樣本分析實現(xiàn)。所有統(tǒng)計學分析及檢驗都使用SPSS軟件及R語言完成。

2 結果與分析

2.1 不同富集時間PP顆粒上附著細菌的多樣性和豐富度指數(shù)

對20個樣品使用Illumina Miseq平臺進行16S rRNA高通量測序，共得到1 282 567條序列，按照97%相似度劃分得到1 081個OUT(可操縱單元)。按照最小樣本序列數(shù)對樣本進行抽平，抽平后共得到860 660條序列。每個樣品抽平后有效序列為43 033條，912個OTU。從抽平后的序列篩選出細菌序列，共860 580條序列，細菌OTU 907個。所有樣品的Chao指數(shù)在158.50～586.14之間，Shannon指數(shù)在0.86～3.05之間(見圖2)。SY海水的富集水樣Chao I指數(shù)明顯高于PP樣品(P<0.01)，說明SY海水的富集水樣中細菌豐富度明顯高于PP樣品；ZQ沉積物富集后，不論是Chao I指數(shù)還是Shannon指數(shù)，富集水樣和PP樣品中細菌的豐富度和多樣性均沒有明顯差別(見圖2)。隨著富集時間的增加，SY海水富集60 d后的細菌多樣性明顯高于0 d的富集樣品(P<0.05)，而ZQ沉積物富集60 d后的細菌多樣性明顯高于富集40、0 d的富集樣品(P<0.05)(見圖3)。

(SW:第三海水浴場海水富集后水樣；SP:第三海水浴場海水富集后微塑料樣品；ZW:棧橋沉積物富集后水樣；ZP:棧橋沉積物富集后微塑料樣品。SW:Water sample form the enrichment culture of on the third bathing beach’s seawater;SP:Microplastics sample form the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;ZW:Water sample form the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment;ZP:Microplastics sample from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment.)圖2 以PP為唯一碳源富集培養(yǎng)青島近海海水和沉積物樣品中細菌的Chao I指數(shù)(A)和香濃指數(shù)(B)箱式圖Fig.2 Box plot of bacterial Chao I (A)和 Shannon(B)diversity indexes in enrichment culture of Qingdao’s coastal seawaters and sediment samples using PP as the sole carbon source

2.2 隨富集時間的變化PP顆粒上的細菌群落演替

SY海水樣品在富集過程中，在PP表面的附著細菌以γ-變型菌綱(γ-Proteobacteria，70.73%～99.37%)和α-變形菌綱(α-Proteobacteria，0.44%～23.39%)為優(yōu)勢細菌類群。富集21 d時放線菌綱(Actinobacteria)細菌豐度增加。而富集培養(yǎng)40 d后，擬桿菌綱(Bacteroidia)細菌豐度明顯增加。隨著富集時間的增加，α-變形菌綱、擬桿菌綱細菌豐度逐漸增加，γ-變形菌綱細菌豐度逐漸下降(見圖4 A)。從屬水平看，富集培養(yǎng)40 d時，假單胞菌屬(Pseudomonas,75.47%)，Methyloversatilis(8.57%)，假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas,2.11%)為富集出的優(yōu)勢屬。在富集時間為60 d時，假單胞菌屬(50.51%)、Methylotenera(12.59%)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium，6.34%)和鞘脂菌屬(Sphingobium，5.09%)為富集優(yōu)勢屬(見圖4 B)。

ZQ沉積物富集培養(yǎng)后，PP表面的附著細菌中，優(yōu)勢綱為γ-變形菌綱(43.65%～95.66%)，其次為α-變形菌綱(1.14%～45.66%)和擬桿菌綱。富集21 d時，放線菌綱細菌豐度增加。隨富集時間的增加，α-變形菌綱、擬桿菌綱、放線菌綱細菌豐度在不斷增加(見圖4 A)。從屬水平看，富集21 d時，假單胞菌屬(Pseudomonas，35.44%)，扎瓦爾金氏菌屬(Zavarzinia，29.14%)、不動桿菌屬(Acinetobacter，13.31%)為優(yōu)勢屬；富集40 d時，扎瓦爾金氏菌屬(29.39%)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas，11.38%)、生絲微菌屬(6.02%)為優(yōu)勢屬；富集60 d 時，亞硝化單胞菌屬(12.61%)、生絲微菌屬(18.71%)和羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter，12.22%)為優(yōu)勢屬(見圖4 B)。

(A.SY海水富集水樣中細菌和PP附著細菌的chao I指數(shù)；B.SY海水富集水樣中細菌和PP附著細菌的shannon指數(shù)；C.ZQ沉積物富集水樣中細菌和PP附著細菌的chao I指數(shù)；D.ZQ沉積物富集水樣中細菌和PP附著細菌的shannon指數(shù)。A.Bacterial Chao I indexes of the water and microplastics samples from the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;B.Bacterial shannon indexes of the water and microplastics samples from the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;C.Bacterial Chao I indexes of the water and microplastics samples from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment;D.Bacterial shannon indexes of the water and microplastics samples from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment.)圖3 SY海水與ZQ沉積物在不同富集培養(yǎng)時間水樣中細菌和PP附著細菌Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)Fig.3 Bacterial Chao I and Shannon indexes of the water and microplastics samples form enrichment cultures of the third bathing beach’s seawater and the sediment of Zhanqiao at different culture times,respectively

使用NMDS(非度量多維尺度分析)依據(jù)PP附著細菌對富集時間、研究站位進行分析，結果表明PP上的附著細菌呈現(xiàn)明顯的區(qū)域化特征(見圖6)，大體分為兩簇，SY和ZQ樣品各聚為一簇。此外，細菌群落隨富集時間的不同也表現(xiàn)出明顯的差異，相同富集時間的細菌群落聚為一簇，較為相似。

2.3 掃描電鏡結果

通過對富集后的PP顆粒進行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)未接種沉積物微生物且放置40 d后的對照組PP顆粒表面光滑平整(見圖7A)；ZQ沉積物在含PP為唯一碳源的培養(yǎng)基中富集40 d后，PP微塑料樣品表面發(fā)生明顯改變(見圖7B)，可以看到有細菌附著于PP微塑料表面。

2.4 富集后可培養(yǎng)細菌的多樣性

將SY海水、ZQ沉積物樣品富集40 d 后的PP樣品上的附著細菌用無菌生理鹽水振蕩后進行分離純化，共獲得40株細菌，分屬于3個門、10個屬，15個種(見圖8)。3個門分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)。變形菌門細菌占絕對優(yōu)勢，占分離菌株的87.5%，包括α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱。其中α-變形菌綱細菌共分離獲得3個屬，3個種，共6株；β-變形菌綱細菌分離獲得1個屬，2個種，共5株；γ-變形菌綱細菌共分離獲得4個屬，6個種，共24株。其次擬桿菌門獲得2株細菌，其中一株為Sphingobacteriummizutaii，一株為Sphingobacteriumdaejeonense。放線菌門獲得3株細菌，其中2株為Microbacteriumresistens，1株為Microbacteriumsuwonense。

(SW:第三海水浴場海水富集后水樣；SP:第三海水浴場海水富集后微塑料樣品；ZW:棧橋沉積物富集后水樣；ZP:棧橋沉積物富集后微塑料樣品。SW:Water sample form the enrichment culture of on the third bathing beach’s seawater;SP:Microplastics sample form the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;ZW:Water sample form the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment;ZP:Microplastics sample from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment.)圖4 不同富集培養(yǎng)時間細菌群落在綱水平(A)和屬水平(B)上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial community at the class (A)and genus (B)levels at different culture times

(SW:第三海水浴場海水富集后水樣；SP:第三海水浴場海水富集后微塑料樣品；ZW:棧橋沉積物富集后水樣；ZP:棧橋沉積物富集后微塑料樣品。SW:Water sample form the enrichment culture of on the third bathing beach’s seawater;SP:Microplastics sample form the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;ZW:Water sample form the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment;ZP:Microplastics sample from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment.)圖5 不同富集培養(yǎng)時間PP微塑料附著細菌群落中豐度前10的細菌科Fig.5 Most abundant (top 10)bacterial families (OTUs)present in the PP microplastic-associated bacterial communities at different culture times

(SY的富集樣品為綠色，ZQ富集樣品為紅色。相同的富集時間的樣品形狀相同。The enrichment samples of the third bathing beach are green,and the enrichment samples of the Zhanqiao are red.Samples with the same enrichment time have the same shapes.)圖6 青島近海微生物不同富集培養(yǎng)時間的細菌群落NMDS分析(stress=0.081)Fig.6 NMDS analysis of the bacterial community in the enrichment cultures of Qingdao’s coastal seawaters and sediment samples at different culture times (stress=0.081)

2.5 分離菌株降解PP的降解率

對富集40 d后的PP顆粒上分離得到的細菌選取15株不同種細菌進行PP降解活性的檢測。分別以1%、10%接種量接種于含PP為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)4周后，發(fā)現(xiàn)不論接種量為1%還是10%，銅綠假單胞菌LXI681(Pseudomonasaeruginosa)、反硝化無色桿菌LXI668(Achromobacterdenitrificans)對PP都有一定的降解作用，且在接種量為10%時，PP降解率分別達2.5%和0.57%。當接種量為1%時，石油假單胞菌LXI654(Pseudomonasoleovoranssubsp.oleovorans)、鞘氨醇桿菌LXI671(Sphingobacteriummizutaii)和羅思河小桿菌LXI601(Rhodanobactersoli)對PP有較高的降解率；抗逆微桿菌LXI659(Microbacteriumresistens)、彎曲假單胞菌LXI602(Pseudomonasgeniculata)對PP沒有降解作用(見圖9)。

(A.對照組；B.實驗組。A.Control group;B.Experimental group.)圖7 棧橋沉積物富集40 d后微塑料樣品的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscope (SEM)of microplastic samples from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment after 40 days of cultivation

(選取綠彎菌門的Kouleothrix aurantiaca COM-B作為外種群，系統(tǒng)發(fā)育樹上的數(shù)字代表自展值，括號中的編號和數(shù)字分別代表Genbank登錄號和屬于相同種的細菌菌株數(shù)。Kouleothrix aurantiaca COM-B from Chloroflexi is used as an out-group.Numbers at each branch point indicate the bootstrap values.The numbers inside brackets represent the Genbank accession numbers and the amount of strains within the same species.)圖8 PP顆粒上分離獲得的40株細菌的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of 40 bacteria strains isolated from PP particles

圖9 富集培養(yǎng)獲得菌株的PP微塑料降解率Fig.9 Degradation rate of PP microplastics by the isolated bacterial strains from the enrichment

3 討論

微塑料普遍存在于表層海水、深海、沉積物甚至是極地等極端環(huán)境中，嚴重影響了海洋生物的安全和健康。PP為近海主要的微塑料污染類型，難以降解導致其在海洋中大量積累，因此，解決微塑料造成的海洋污染逐漸引起科學家的重視。目前研究微生物在PP顆粒上的群落演替及PP降解微生物的篩選、活性檢測等相關的研究較少。故本實驗采用以PP為唯一碳源對青島近海微生物進行富集培養(yǎng)，以期揭示微生物在PP微塑料上的優(yōu)勢類群并獲得潛在的PP降解菌為緩解塑料污染帶來的海洋生態(tài)問題提供微生物菌種資源。

通過對青島近海微生物以PP為唯一碳源進行富集培養(yǎng)，其16S rRNA高通量測序結果表明，采用SY海水樣品進行富集培養(yǎng)時，富集水樣中的細菌豐富度明顯高于富集微塑料樣品。這一結果與Zettler等[35]分析北大西洋海水和PP微塑料上細菌群落的α-多樣性結果一致。Harrison等[36]在研究中也指出微塑料上的微生物群落不同于周圍海水，微塑料為微生物提供了新型的棲息地，特別是在早期定植階段，微生物會選擇性的附著在微塑料上。然而，采用棧橋沉積物富集培養(yǎng)時，富集水樣與微塑料樣品中細菌的多樣性與豐富度沒有明顯區(qū)別。這可能與沉積物中微生物的多樣性及富集培養(yǎng)時間有關。隨富集時間的增加，PP附著細菌的多樣性增加(見圖3)。Lobelle等[15]發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時間的增加，塑料的親水性不斷增加，生物被膜的產生量也不斷增加。故推測富集培養(yǎng)早期細菌群落多樣性低，可能由于微塑料的疏水性且表面營養(yǎng)物質匱乏從而不利于早期細菌的定植；富集培養(yǎng)后期，微塑料表面細菌多樣性增加，可能由于生物被膜的形成改變了微塑料表面的性質使其利于細菌定植。NMDS分析結果顯示相同富集時間的群落聚為一簇，表明相同富集時間細菌的群落結構較為相似，不同富集時間附著在微塑料上的細菌群落存在明顯差異。這一結果與Xu等[2]在中國近海研究微塑料上細菌的群落演替結果較為一致。另外，微塑料上的細菌群落與樣品來源和微塑料類型有關，不同的樣品來源和微塑料類型，在富集培養(yǎng)過程中微塑料上的附著細菌群落有明顯差異[18-19]。

本研究在分析微塑料附著細菌的物種組成時，發(fā)現(xiàn)不論是富集培養(yǎng)ZQ沉積物樣品還是SY海水樣品，γ-變形菌綱、α-變形菌綱細菌在PP微塑料上均占主導地位。該結果與Curren等[37]在研究熱帶沿海環(huán)境微塑料上的細菌群落組成相似。另外，Xu等[2]在研究中國近海海域細菌對地理位置、暴露時間和塑料類型的響應及群落演替中，發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱、α-變形菌綱、黃桿菌綱在微塑料(PP和PVC)附著細菌群落中占主導地位。需要注意的是，在富集培養(yǎng)早期，富集水樣中的細菌群落與已報道的海水、沉積物微生物群落組成有所區(qū)別，推測是由于近海海域受人類活動影響較大從而影響其群落結構。

本研究在富集培養(yǎng)SY海水樣品及ZQ沉積物后期，PP微塑料上豐度較高的科為假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、Acetobacterales_Incertae_Sedis、亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae)、生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)、Rhodanobacteraceae和黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)(見圖5)。已有研究表明微塑料可以作為碳源為海洋微生物提供能量[20-23]。研究發(fā)現(xiàn)，從不同環(huán)境中分離出的假單胞菌屬細菌可以降解多種微塑料，如PE、PP、PS、PVC、PET等[38]。Gyung Yoon等[39]從原油污染嚴重的海灘樣品中分離出的假單胞菌屬細菌具有降解低密度聚乙烯(Low-Molecular-Weight Polyethylene)的能力。因此，本研究以PP為唯一碳源富集培養(yǎng)獲得的假單胞菌屬細菌可能具有PP降解潛力。Amaral-Zettler等[40]從2013年7—11月在美國馬薩諸塞州伍茲霍爾碼頭進行了海洋微生物在高密度聚乙烯(High-Density Polyethylene)上的原位定植實驗，通過二代測序技術發(fā)現(xiàn)，隨時間的推移黃單胞菌科細菌豐度增加，與本研究結果相似。Brandon等在分析粉蟲腸道菌群中發(fā)現(xiàn)黃單胞菌科細菌與PS降解相關，因此推測富集后期豐度較高的黃單胞菌科細菌也具有PP降解潛力。另外，ZQ沉積物富集后期，PP附著細菌群落中扎瓦爾金氏菌屬細菌的豐度增加，表明其可能具有PP降解潛力。Tourova 等[41]發(fā)現(xiàn)扎瓦爾金氏菌屬細菌具有降解PS基因的操縱子，可能具有PS降解潛力。然而，在本研究的分離培養(yǎng)實驗中，未獲得扎瓦爾金氏菌屬細菌菌株，可能與分離培養(yǎng)條件不適合其生長有關，在后續(xù)對微塑料降解菌的富集培養(yǎng)和分離純化中應考慮采用多種培養(yǎng)基，包括以微塑料為唯一碳源的培養(yǎng)基進行篩選，以獲得更多的微塑料降解菌。

本研究對選取的15株不同種細菌進行了PP微塑料降解活性檢測。結果表明，當以10%接種量接種到含PP微塑料為唯一碳源的培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)4周后，銅綠假單胞菌LXI681、反硝化無色桿菌LXI668對PP微塑料有一定的降解活性，降解率分別為2.5%和0.57%。Rajandas等[42]發(fā)現(xiàn)在兩個月的時間里，銅綠假單胞菌可以降解50.5%的低密度聚乙烯，而本實驗中分離得到的銅綠假單胞菌LXI681在室溫放置4周后對PP的降解率為2.5%，降解率較低。在Arkatkar等[43]的研究中也發(fā)現(xiàn)PP不論有無化學處理，生物都很難對其降解。因此后續(xù)降解實驗可適當延長培養(yǎng)時間以增加其降解率。此外，Kowalczyk等[44]的研究證實無色桿菌屬細菌對高密度聚乙烯有一定的生物降解作用，而本實驗篩選得到的反硝化無色桿菌LXI668對PP有一定的降解能力，表明同種微塑料降解菌可能對多種類型的微塑料均具有一定的降解能力。

綜上，本研究通過16S rRNA高通量測序技術分析了研究青島近海微生物隨富集時間的不同在PP顆粒上的群落演替，揭示了富集后期PP微塑料上附著細菌的優(yōu)勢類群。通過篩選發(fā)現(xiàn)了具有PP降解活性的細菌如銅綠假單胞菌LXI681、反硝化無色桿菌LXI668，豐富了PP微塑料降解細菌資源庫，對緩解海洋微塑料污染及改善海洋生態(tài)具有重要的應用價值。