王超萍，劉凡啟，嚴(yán)戰(zhàn)偉，尹向田*，丁燕*

（1.山東省葡萄研究院/山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250100；2.山東新豐農(nóng)業(yè)開發(fā)股份有限公司，山東威海 264500；3.北京張?jiān)垤潮H酒莊有限公司，北京 101500）

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），屬半知菌綱，叢梗孢目，叢梗孢科，葡萄孢屬，是產(chǎn)生貴腐作用的病原菌[1]。該菌的寄生范圍比較廣[2]，可以侵染200多種植物的不同組織，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有較大危害[3-4]。在葡萄貯存中，灰葡萄孢菌繁殖速率快，變異率高，適應(yīng)性強(qiáng)[5]，造成的損失最為嚴(yán)重[6]。2013年10月，美國加州大學(xué)金海翎教授發(fā)現(xiàn)灰霉菌是世界上首個(gè)可以利用小分子RNA達(dá)到有效侵染的病原菌，由此開啟了一個(gè)新的研究方向[7]。

葡萄果實(shí)成熟期間，在夜間迷霧濕度大而白天晴朗干燥的干濕交替條件下，貴腐菌才能對(duì)葡萄果實(shí)發(fā)生適度侵染，導(dǎo)致果實(shí)在樹體上天然濃縮。貴腐菌在侵染過程中改變了葡萄的新陳代謝，刺激果實(shí)產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步豐富了葡萄的風(fēng)味物質(zhì)，使釀成的貴腐酒有別于其他甜葡萄酒，具有獨(dú)特的風(fēng)味。

乳山位于山東半島東南部，地處北緯36°41′～37°08′，東經(jīng)121°11′～121°51′，屬暖溫帶東亞季風(fēng)型大陸性氣候，四季變化和季風(fēng)進(jìn)退較明顯。但與同緯度的內(nèi)陸相比，具有氣候溫和、雨水豐沛、光照充足、無霜期長(zhǎng)的特點(diǎn)。該地以砂質(zhì)壤土為主，透氣性好，排水容易，極有利于葡萄生長(zhǎng)。獨(dú)特的小氣候造就了乳山葡萄酒特有的產(chǎn)區(qū)風(fēng)格，也為貴腐菌的侵染提供了可能。

由于氣候條件對(duì)天然貴腐作用的發(fā)生起著關(guān)鍵影響，除了歐洲傳統(tǒng)的優(yōu)質(zhì)貴腐酒產(chǎn)區(qū)外，世界上其他釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)很難在自然條件下使葡萄發(fā)生貴腐作用，因此貴腐酒非常珍貴，目前國內(nèi)沒有批量生產(chǎn)。

Caseys等[8]為了揭示灰葡萄孢的寄主特異性和致病性的遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)灰葡萄孢在整個(gè)植物界的侵染結(jié)果進(jìn)行分析，從8種寄主植物的90種基因型上，生成98株灰霉病菌的傳染性矩陣，結(jié)果表明主要是由寄主抗性或病原體毒力的變化所解釋。蘭圓圓等[1]利用從感染灰霉菌的番茄果實(shí)、青菜豆果實(shí)和葉子上分離得到了灰葡萄孢菌，并成功進(jìn)行了人工侵染得到貴腐葡萄；安榮艷等[9]報(bào)道‘霞多麗’貴腐酒研究采用的菌種選自感染了灰霉病的果蔬染病組織，通過不同條件下灰葡萄孢菌種的β-葡萄糖苷酶酶活的測(cè)定與比較，最終選定編號(hào)為Botrytis-T的菌株作為人工貴腐葡萄的侵染使用菌株；汪蕾等[10]在賀蘭山東麓貴腐葡萄特征研究中，從‘威代爾’葡萄上分離得到菌株，經(jīng)過光學(xué)顯微鏡觀察灰葡萄孢為表層侵染，確定其是造成感染的微生物；黃露莉等[11]研究的人工貴腐‘玫瑰蜜’葡萄酒采用的菌種是從‘夏黑’葡萄果實(shí)上分離得到，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定為灰葡萄孢。此外，也有研究人員對(duì)灰葡萄孢在不同條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行對(duì)比分析，楊玉紅等[12]調(diào)查了不同碳源、pH、光照、溫度條件對(duì)菌種的影響，得出灰霉菌在以下條件生長(zhǎng)發(fā)育較快：馬鈴薯＋葡萄糖培養(yǎng)基，pH5～6、18～26 ℃，每天給予8 h的光照。李寧等[13]探索了在搖瓶液體培養(yǎng)條件下，不同碳源、氮源和無機(jī)鹽對(duì)灰葡萄孢液體深層培養(yǎng)的影響，確定了最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖3%、土豆汁4%、硝酸鉀0.1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%；最佳培養(yǎng)條件為溫度26 ℃、pH 5.5、轉(zhuǎn)速120 r/min。在乳山田間試驗(yàn)觀察到晚收的釀酒葡萄‘貴人香’果實(shí)表面前期為黑褐色，呈皺縮甚至干癟狀態(tài)，但果肉完好未腐爛，表現(xiàn)出典型的“貴腐”特征，因此采樣作為研究對(duì)象進(jìn)行篩菌鑒定，并研究菌株的最佳培養(yǎng)條件。該研究將為中國貴腐酒的研制及其菌種分子生物學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳山臺(tái)依湖酒莊10月底11月初的晚摘感染貴腐病害的釀酒葡萄‘貴人香’。

培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、葡萄汁瓊脂培養(yǎng)基（自制）、葡萄枝條瓊脂培養(yǎng)基（自制）、MEA麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、PDA改良培養(yǎng)基（1/2PDA＋1/2MEA）；主要試劑為葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、麥芽糖、牛肉膏、酵母粉、酵母膏、麥芽浸膏、尿素、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、硝酸鈉。以上培養(yǎng)基、試劑均購自濟(jì)南賽傲生物技術(shù)有限公司。真菌基因組DNA提取試劑盒：Omega，D3390；DNA純化回收試劑盒：購自天根生化科技（北京）有限公司，DP214；引物：由生工生物工程股份有限公司合成，按照合成單加入ddH2O，制成10 μmol溶液。

1.2 主要儀器與設(shè)備

無菌打孔器：購自濟(jì)南賽傲生物技術(shù)有限公司；光學(xué)顯微鏡：意大利Optika；菌種分離超凈臺(tái)：蘇凈安泰。

1.2 方法

1.2.1 貴腐菌的篩選

采用常規(guī)組織分離方法[11]。選取感染貴腐菌病的釀酒葡萄‘貴人香’，用無菌挑針選取葡萄表皮感染貴腐菌的病健交接組織，大小約為3 mm×3 mm，用75%的酒精消毒30 s，再用無菌水沖洗3次，用無菌鑷子將挑取的組織置于PDA培養(yǎng)基上，鋪平，27 ℃下培養(yǎng)3～5 d。從分離的菌落中挑選具有典型性狀的無雜菌菌落重新接種到PDA平板上。相同溫度條件下，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d。如此反復(fù)，直至菌落形態(tài)一致時(shí)保留分離出的菌株，并將其保存在PDA培養(yǎng)基中。

1.2.2 貴腐菌的鑒定

菌落形態(tài)學(xué)觀察：將純化好的菌種選取3株，取單菌落接種至改良PDA[14]培養(yǎng)基上，于27 ℃下培養(yǎng)3 d，觀察單菌落、菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)速度、顏色等特征變化，使用十字交叉法測(cè)定并記錄菌落直徑大小。

菌絲及孢子形態(tài)學(xué)觀察：在400倍顯微鏡下觀察菌株分生孢子形態(tài)。

貴腐菌的分子生物學(xué)鑒定[15]：使用真菌DNA小量提取試劑盒D3390提取DNA，用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用普通瓊脂糖凝膠DNA試劑盒回收。產(chǎn)物委托青島派森諾基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將得到的ITS rDNA序列用NCBI Blast程序與NCBI ribosomal RNA sequence數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 4.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.2.3 貴腐菌培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基的選擇：選用PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、葡萄汁瓊脂培養(yǎng)基、葡萄枝條瓊脂培養(yǎng)基、MEA麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、PDA改良培養(yǎng)基（1/2PDA＋1/2MEA）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。使用打孔器在供試菌落邊緣打取菌餅[17]，然后將菌餅用挑針轉(zhuǎn)接到6種不同的培養(yǎng)基上，在27 ℃條件下培養(yǎng)3 d，使用十字交叉法測(cè)定并記錄菌落大小，3次重復(fù)。

碳源的選擇：以改良的PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別選用1%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、麥芽糖、果糖代替PDA培養(yǎng)基中的碳源，其他操作同培養(yǎng)基篩選，3次重復(fù)。

氮源的選擇：以改良的PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別選用1%的牛肉膏、酵母粉、酵母膏、麥芽浸膏、尿素、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、硝酸鈉代替PDA培養(yǎng)基中的氮源，其他操作同培養(yǎng)基篩選，3次重復(fù)。

pH選擇：以改良PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH調(diào)整pH，梯度分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11。制成不同的pH梯度的平板分別接菌，其他操作同培養(yǎng)基篩選，3次重復(fù)。

溫度的選擇：以改良PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別在4、10、15、20、25、30、35 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，其他操作同培養(yǎng)基，3次重復(fù)。

光照的選擇：在25 ℃條件，改良的PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，3個(gè)菌株在無光照、光照、光照及無光照時(shí)間各半的情況下培養(yǎng)，其他操作同培養(yǎng)基篩選，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的形態(tài)分析

2.1.1 灰葡萄孢的形態(tài)學(xué)鑒定

試驗(yàn)共分離到68株菌，選取3株疑似貴腐菌株的菌落進(jìn)行培養(yǎng)。初期菌落灰白色，周圍光滑、規(guī)則，后期菌絲變成鼠灰色，第7天孢子開始發(fā)芽，菌絲密集，氣生菌絲發(fā)達(dá)，基內(nèi)菌絲結(jié)成團(tuán)，3～4 d后開始產(chǎn)生孢子。孢子頭密布，邊緣處密度較大，培養(yǎng)10 d開始形成菌核。菌核緊密貼生在培養(yǎng)基表面，圓盤形，灰黑色，大小為7 mm。在光學(xué)顯微鏡下觀察到的菌株孢子形態(tài)如圖1、圖2、圖3，孢子梗叢生，有隔膜，孢子呈球形或者橢圓形，單胞，通過對(duì)比《真菌鑒定手冊(cè)》[18]，初步鑒定為灰葡萄孢。

圖1 菌株1菌落及孢子形態(tài)Figure 1 Colony and spore morphology of strain 1

圖2 菌株2菌落及孢子形態(tài)Figure 2 Colony and spore morphology of strain 2

圖3 菌株3菌落及孢子形態(tài)Figure 3 Colony and spore morphology of strain 3

2.2 貴腐菌的分子生物學(xué)鑒定

利用通用引物ITS1/ITS4對(duì)菌株1、菌株2、菌株3的ITS rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序獲得目的基因片段分別為526 bp、503 bp、510 bp，經(jīng)Blast搜索并與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進(jìn)行同源性比較，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。發(fā)現(xiàn)3株菌株均與灰葡萄孢的基因序列同源性相近，同源率在99.23%以上。挑選親緣性較高的同屬不同種的菌株作為參比菌株，并采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株1、菌株2、菌株3分別與參比菌株B.cinereaZ17 KC172064.1、B.cinereaLW6 MN077161.1、B.cinereaQ1 MT704983.1同源性相近。結(jié)合形態(tài)特征鑒定結(jié)果，可將3株菌鑒定為B.cinerea，分別命名為GRX06、GRX08、GRX62（圖4）。

圖4 基于ITS rDNA序列構(gòu)建的貴腐菌和相關(guān)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree of B.cinerea and related fungi based on ITS rDNA sequence

2.3 菌種培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基及其成分的選擇

（1）基本培養(yǎng)基的選擇。通過對(duì)3個(gè)菌株在6種不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)，根據(jù)3 d后菌落直徑測(cè)量結(jié)果及柱狀圖（圖5）可以發(fā)現(xiàn)，3株菌株在所選培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但在PDA改良培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況最佳，菌落直徑分別為6.78 cm、6.95 cm、7.06 cm。

圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)3株菌株生長(zhǎng)情況的影響Figure 5 Effect of different culture media on three strains growth

（2）碳源的選擇。通過對(duì)3株菌株在6種不同碳源的改良PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)菌落直徑的測(cè)量可以發(fā)現(xiàn)，3株菌株均能很好的利用這6種碳源，但對(duì)碳源優(yōu)劣次序不同。GRX62的最佳碳源為甘露醇，菌落直徑5.13 cm；GRX06的最佳碳源為葡萄糖，菌落直徑4.47 cm；GRX08的最佳碳源為甘露醇，菌落直徑4.22 cm（圖6）。

圖6 碳源對(duì)3株菌株生長(zhǎng)情況的影響Figure 6 Effect of carbon sources on strains growth

（3）氮源的選擇。通過對(duì)3個(gè)菌株在9種不同氮源的PDA改良培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)菌落直徑可以發(fā)現(xiàn)，3株菌株在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上幾乎不生長(zhǎng)，在其他氮源培養(yǎng)基上菌體生長(zhǎng)正常，而且3株菌株的氮源優(yōu)劣次序不同。GRX62最佳氮源為酵母粉，菌落直徑為6.48 cm；GRX06的最佳氮源為牛肉膏，菌落直徑為6.47 cm；GRX08的最佳氮源為硝酸鉀，菌落直徑6.35 cm（圖7）。

圖7 不同氮源對(duì)3株菌株生長(zhǎng)情況的影響Figure 7 Effect of nitrogen sources on growth of three strains

（4）pH值優(yōu)化。通過對(duì)3個(gè)菌株在9種不同pH培養(yǎng)基的培養(yǎng)，根據(jù)菌落直徑的測(cè)量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)（圖8），3株菌株在偏中性的培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好。GRX62和GRX08在不同的pH下均能生長(zhǎng)，GRX06在pH為3、4的情況下基本不生長(zhǎng)。GRX62的最佳pH為8，菌落直徑為6.70 cm；GRX06的最佳pH為6，菌落直徑為7.15 cm；GRX08的最佳pH為6，菌落直徑為6.55 cm。

圖8 不同pH對(duì)3株菌株生長(zhǎng)情況的影響Figure 8 Effect of different pH on growth of three strains

2.3.2 培養(yǎng)條件的選擇

（1）溫度條件優(yōu)化。對(duì)3菌株在7個(gè)溫度處理下進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基菌落直徑的測(cè)量數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，溫度低于4 ℃及高于35 ℃時(shí)，菌落幾乎不生長(zhǎng)。GRX62在溫度為20 ℃時(shí)，菌落直徑最大為6.47 cm；GRX62在25 ℃時(shí)，菌落直徑最大為7.15 cm；GRX08在溫度為25 ℃時(shí)，菌落直徑最大為6.55 cm（圖9）。

圖9 不同溫度對(duì)3株菌株生長(zhǎng)情況的影響Figure 9 Effect of temperatures on growth of three strains

（2）光照條件優(yōu)化。對(duì)3菌株在3種不同光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基菌落直徑的測(cè)量數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，菌落大小變化不大，GRX62和GRX06的最佳光照時(shí)間均為全光照，菌落直徑分別為6.47、6.15 cm；GRX08菌株在黑暗的條件下長(zhǎng)得最好，菌落直徑是5.91 cm（圖10）。

圖10 不同光照處理對(duì)3株菌株生長(zhǎng)情況的影響Figure 10 Effect of illumination treatment on growth of three strains

3 討論與結(jié)論

從乳山臺(tái)依湖酒莊的疑似發(fā)生貴腐作用的晚收釀酒葡萄‘貴人香’上分離篩選出3株貴腐菌GRX62、GRX06、GRX08。通過形態(tài)學(xué)、生理生化及ITS rDNA鑒定，確定3株菌株均為貴腐菌（Botrytis cinerea）。試驗(yàn)結(jié)果表明，GRX62的最佳培養(yǎng)條件為：改良PDA培養(yǎng)基、碳源為甘露醇、氮源為酵母粉、pH為8、溫度為20 ℃，光照時(shí)間72 h；GRX06的最佳培養(yǎng)條件為：改良PDA培養(yǎng)基、碳源為葡萄糖、氮源為牛肉膏、pH為6、溫度為25 ℃，全光照；GRX08的最佳培養(yǎng)條件為：改良PDA培養(yǎng)基、碳源為甘露醇、氮源為硝酸鉀、pH為6、溫度為25 ℃，暗培養(yǎng)。試驗(yàn)中選出的培養(yǎng)基基本與金其榮[19]等研究得出的結(jié)論一樣，均為改良PDA培養(yǎng)基。

試驗(yàn)中貴腐菌的生長(zhǎng)溫度及光照條件，與雷百戰(zhàn)、張鵬等[20-21]的研究結(jié)果一致；最適pH值也與李廷剛等[22]的結(jié)果相同。對(duì)貴腐菌的生長(zhǎng)條件進(jìn)行探索，不僅有利于認(rèn)識(shí)貴腐菌的生物學(xué)特性和發(fā)生特點(diǎn)，在與土壤碳、氮等利用關(guān)系方面也有重要意義[23]。

山東是中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)最好的地區(qū)，擁有張?jiān)?、威龍、煙臺(tái)長(zhǎng)城等一線品牌和蓬萊、乳山酒莊集群等，也是中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的風(fēng)向標(biāo)。試驗(yàn)首次從臺(tái)依湖酒莊的晚收‘貴人香’葡萄中篩選出可以釀造貴腐酒的菌種，將為葡萄貴腐菌的分子生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)材料，為推動(dòng)膠東地區(qū)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，豐富葡萄酒產(chǎn)品類型有重要意義。