姜利霞，王玉海，何世成，胡巧云，王衛(wèi)國(guó)，魯杏華，武維保，謝怡靈，王昌建

（1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙 410014；2.永州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南永州，425002；3.永定區(qū)科技和工業(yè)信息化局，湖南張家界 427000；4.漢壽縣畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南漢壽 415900）

牛病毒性呼吸系統(tǒng)疾病多由一種或數(shù)種病毒混合感染造成，在牛群中導(dǎo)致高感染率、高發(fā)病率，給國(guó)內(nèi)外養(yǎng)牛業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。牛皰疹病毒（bovine herpesvirus 1，BHV-1）又稱傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinortracheitis virus，IBRV），臨床特征為呼吸困難和體溫升高，有鼻炎、咽炎、喉炎和氣管炎等呼吸道癥狀，還可引起結(jié)膜炎、機(jī)體免疫功能降低、流產(chǎn)、免疫抑制、腦炎和全身性感染，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病[2-4]。牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratory syneytial virus，BRSV）是單股負(fù)鏈RNA 病毒，可引起牛和其他反芻動(dòng)物發(fā)生熱性、急性呼吸系統(tǒng)疾病[5]，患病動(dòng)物表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸不暢、肺炎、肺氣腫和肺水腫等癥狀，臨床上發(fā)病率較高，但死亡率較低。牛副流感病毒3 型（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3）是一種能引起牛組織損傷和免疫抑制，以侵害呼吸系統(tǒng)為主的急性、熱性、接觸性呼吸道傳染病[6]，又稱為運(yùn)輸性肺炎，容易與其他病毒或細(xì)菌混合感染，導(dǎo)致病牛病情加重，死亡率大幅度升高，給養(yǎng)牛業(yè)帶來很大經(jīng)濟(jì)損失[7]。牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是一種免疫抑制性病毒，可導(dǎo)致牛病毒性腹瀉/黏膜病（bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD），是一種能引起牛、羊、豬以腹瀉和消化道壞死為主要特征的急性、熱性、接觸性傳染病，我國(guó)將其列為三類動(dòng)物疫病[8-10]。

上述4 種牛病毒容易發(fā)生混合感染，引起的臨床癥狀較為相似，很難區(qū)分，加大了臨床診斷難度。因此迫切需要一種能夠同時(shí)檢測(cè)BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 的多重?zé)晒釶CR 方法，以便快速、準(zhǔn)確作出臨床診斷。本研究基于BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 各自的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了一種可同時(shí)檢測(cè)4 種牛病毒的多重?zé)晒釶CR 檢測(cè)技術(shù)，為這4 種疫病的診斷與防控提供了便捷、靈敏、準(zhǔn)確的診斷方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 細(xì)菌和疫苗 牛布魯氏菌，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬瘟病毒活疫苗，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供；小反芻獸疫弱毒疫苗，由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；羊多殺性巴氏桿菌，由湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 引物和探針，由上海生工生物工程有限公司合成；BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 陽性重組質(zhì)粒（pUC57 載體），由北京擎科生物有限公司合成；質(zhì)粒DNA 提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；一步法反轉(zhuǎn)錄RNA 酶、一步法反轉(zhuǎn)錄2×Mix，購(gòu)自國(guó)測(cè)生物科技有限公司；MM400 組織研磨儀，來自德國(guó)Retsch 公司；ABI-7500 熒光PCR 儀、紫外分光光度計(jì)，來自Thermo Scientific 公司。

1.1.3 樣品來源 865 份臨床牛肺和血清樣品，于2020 年2—10 月采集自湖南省某屠宰場(chǎng)。其中牛肺樣品采自牛肺中明顯病變部位，血清樣品為牛頸靜脈或尾根靜脈血經(jīng)離心后收集。使用DNA/RNA 提取試劑盒提取樣品核酸。

1.2 引物與探針設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中下載的BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 病毒基因序列，分別以BHV-1gB基因、BRSVF基因、BPIV-3M基因和BVDV 5'UTR 序列作為靶基因，利用Prime Express 5.0 軟件對(duì)這4 種基因的保守序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)4 對(duì)特異性引物及4 個(gè)由不同發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針（表1）。引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

表1 多重?zé)晒釶CR 引物和探針

1.3 BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 陽性重組質(zhì)粒構(gòu)建

選取BHV-1gB基因、BRSVF基因、BPIV-3M基因和BVDV 5'UTR 區(qū)域基因的特異性保守序列與pUC57 載體連接，構(gòu)建BHV-l、BRSV、BPIV-3 和BVDV 的陽性重組質(zhì)粒序列，由北京擎科生物科技有限公司完成陽性重組質(zhì)粒的合成、連接和轉(zhuǎn)化。得到陽性重組質(zhì)粒后使用分光光度計(jì)測(cè)量其濃度。

1.4 單重?zé)晒釶CR 反應(yīng)條件建立與優(yōu)化

以陽性重組質(zhì)粒作為模板，分別進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照（ddH2O）。BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 單重?zé)晒釶CR 初始反應(yīng)條件：一步法反轉(zhuǎn)錄2×Mix 12.5 μL，一步法反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，上、下游引物分別為0.8 μL，探針0.5 μL，陽性重組質(zhì)粒3.0 μL，然后加水補(bǔ)足至25.0 μL。

引物與探針濃度優(yōu)化：將各個(gè)病毒的上下游引物與探針稀釋至10 μmol/μL，引物濃度范圍設(shè)置為0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 μmol/μL，探針濃度范圍設(shè)置為0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36 μmol/μL，通過排列組合得到多種組合方式。將每個(gè)組合方式的引物和探針對(duì)進(jìn)行單重?zé)晒釶CR 反應(yīng)，篩選出有最小Ct 值和最佳擴(kuò)增曲線的引物探針組合，確定最佳引物與探針濃度。

初始反應(yīng)程序：50 ℃ 20 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。將退火溫度設(shè)定為55、56、57、58、59、60 ℃，設(shè)置6 個(gè)試驗(yàn)組，同時(shí)在確定退火溫度的情況下對(duì)循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，循環(huán)次數(shù)按30、35、40、45 設(shè)置，確定最佳單重?zé)晒釶CR 反應(yīng)程序。

1.5 多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)條件建立與優(yōu)化

1.5.1 反應(yīng)條件優(yōu)化 在最佳單重?zé)晒釶CR 反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)體系和程序。將已經(jīng)優(yōu)化好的單重?zé)晒釶CR 體系的相應(yīng)引物與探針混合加至同一體系中，進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)。根據(jù)四重?zé)晒釶CR 擴(kuò)增結(jié)果Ct 值大小、熒光值高低和擴(kuò)增曲線變化來調(diào)整引物對(duì)在混合引物中的比例和探針濃度，采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行多重?zé)晒釶CR 擴(kuò)增。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 以8.268×（109～103）copies/μL的10 倍梯度稀釋的陽性重組質(zhì)粒作為模板，按上述優(yōu)化好的反應(yīng)體系及條件，對(duì)每個(gè)稀釋度的模板進(jìn)行擴(kuò)增。

1.6 多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)驗(yàn)證

1.6.1 特異性試驗(yàn) 采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 方法檢測(cè)牛布魯氏菌、豬瘟病毒、小反芻獸疫病毒、羊多殺性巴氏桿菌等病原，以驗(yàn)證該方法的特異性。將多重?zé)晒釶CR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠電泳檢測(cè)，記錄并分析結(jié)果。

1.6.2 敏感性試驗(yàn) 將陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋，采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 方法，對(duì)濃度為103～100copies/μL 的模板進(jìn)行檢測(cè)，通過檢測(cè)結(jié)果確定本方法的最低檢出量。

1.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 以稀釋成106～104copies/μL的陽性重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 方法對(duì)每種模板進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組，根據(jù)結(jié)果計(jì)算變異系數(shù)（CV）；組間重復(fù)試驗(yàn)：采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 方法每隔5 d 對(duì)每種模板進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組，根據(jù)結(jié)果計(jì)算CV。

1.7 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)采集自湖南省某屠宰場(chǎng)的865 份牛肺和血清臨床樣品，采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 方法進(jìn)行檢測(cè)，收集檢測(cè)數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 測(cè)序驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證臨床樣品陽性結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性，以BHV-1gB基因、BRSVF基因、BPIV-3M基因和BVDV 5'UTR 序列作為靶基因，參考文獻(xiàn)[11-14]中的引物序列（表2），擴(kuò)增其基因片段，送北京擎科生物有限公司測(cè)序。將得到的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，驗(yàn)證本方法檢測(cè)的陽性結(jié)果是否含有病毒對(duì)應(yīng)序列。

表2 普通PCR 引物

2 結(jié)果

2.1 BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 陽性重組質(zhì)粒濃度測(cè)定

對(duì)BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 4 種 陽性重組質(zhì)粒分別使用分光光度計(jì)測(cè)量其質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)4 種陽性重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度均為112.1 ng/μL，即8.268×1010copies/μL。

2.2 多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)優(yōu)化結(jié)果

多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)體系：BHV-1F/R 0.8 μL（0.32 μmol/μL），BHV-1P 0.6 μL（0.24 μmol/μL）；BRSV-F/R 0.8 μL（0.32 μmol/μL），BRSV-P 0.7 μL（0.28 μmol/μL）；BPIV-3F/R 0.7 μL（0.28 μmol/μL），BPIV-3P 0.5 μL（0.20 μmol/μL）；BVDV-F/R 0.8 μL（0.32 μmol/μL），BVDV-P 0.4 μL（0.16 μmol/μL）；一步法反轉(zhuǎn)錄2×Mix 12.5 μL，一步法反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，DNA 模板3.0 μL，最后加ddH2O 補(bǔ)足至25.0 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 20 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋，采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 方法對(duì)濃度為8.268×（109～103）copies/μL 的模板進(jìn)行檢測(cè)，分別獲得了BHV-1、BRSV、BPIV-3、BVDV的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 4 種病毒多重?zé)晒釶CR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性試驗(yàn)

采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 方法，以牛布魯氏菌、豬瘟病毒、小反芻獸疫病毒、羊多殺性巴氏桿菌等病原核酸作為模板，同時(shí)以合成的陽性重組質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，ddH2O 作為陰性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除陽性重組質(zhì)粒有Ct 值和熒光值變化，其余核酸模板及陰性對(duì)照均無Ct 值和熒光值變化（圖2），表明該方法特異性強(qiáng)，可用于BHV-1、BRSV、BPIV-3、BVDV 的鑒別診斷。多重?zé)晒釶CR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 分別擴(kuò)增出126、110、106 和126 bp 的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致（圖3）。

圖2 多重?zé)晒釶CR 特異性檢測(cè)結(jié)果

圖3 4 種病毒多重?zé)晒釶CR 檢測(cè)目的片段

2.5 敏感性試驗(yàn)

將陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋，采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 方法對(duì)濃度為8.268×（103～100）copies/μL 的模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 的cDNA 最低檢測(cè)量分別為8.268、82.680、8.268、8.268 copies/μL（表3），表明該方法對(duì)4 種病毒檢測(cè)具有較高的靈敏性。

表3 多重?zé)晒釶CR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 方法對(duì)BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算CV。結(jié)果顯示，CV 幾乎低于1%，部分?jǐn)?shù)值從1%到2%不等（圖4 及表4），表明本試驗(yàn)所建立的多重?zé)晒釶CR 方法有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表4 多重?zé)晒釶CR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖4 多重?zé)晒釶CR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 測(cè)序驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)采用本研究建立的方法檢測(cè)為陽性的部分臨床樣本利用PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段大小。將PCR 產(chǎn)物送測(cè)序，對(duì)測(cè)序后的基因序列進(jìn)行拼接，用NCBI 上的BLAST 開展比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GenBank 中BHV-1、BRSV、BPIV-3、BVDV核酸序列同源性均為99%（圖5），表明所建立的四重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法，具有較高的準(zhǔn)確性，可用于臨床病料檢測(cè)。

圖5 核酸序列同源性比對(duì)結(jié)果

2.8 臨床樣品檢測(cè)

采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法對(duì)來自湖南省某屠宰場(chǎng)（2020 年2—10 月）的865份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)檢測(cè)樣品Ct ≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，即出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，則確認(rèn)BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 陽性；當(dāng)檢測(cè)樣品35 ＜Ct ≤38，判定為可疑，需重新檢測(cè)一次：若Ct ＜38，且擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，可判定結(jié)果為陽性，否則為陰性；檢測(cè)結(jié)果無Ct 或39 ≤Ct ≤40 且38 個(gè)循環(huán)內(nèi)未出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，則確認(rèn)為BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 陰性。結(jié)果（表5）顯示，BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 等4 種病原均有檢出，其中6 月份BVDV 檢測(cè)率最高，為5.15%，其次為8 月份的BRSV，檢出率為4.07%；BHV-1 檢出多在2 月（1.49%）和8 月（0.58%），BRSV 檢出多在8月（4.07%），BPIV-3 檢出多在7 月（1.09%），BVDV 檢出多在6 月（5.15%），其他月份未檢出4 種病毒陽性。由以上數(shù)據(jù)可知，不同病原在不同時(shí)間的陽性檢出率不同，其中BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 在秋冬季較高，而在其他季節(jié)較低甚至無檢出。

表5 湖南省某屠宰場(chǎng)樣品2020 年2—10 月4 種牛病毒檢測(cè)情況

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，規(guī)?；B(yǎng)殖不斷發(fā)展，多種病原混合感染呈上升趨勢(shì)。牛呼吸系統(tǒng)病毒病病因復(fù)雜，其中BHV-1、BRSV 和BPIV-3 引起的臨床癥狀較為相似，導(dǎo)致臨床上的鑒別診斷變得困難。這4 種牛病毒可引起牛群高感染率、高發(fā)病率，對(duì)于養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展影響十分嚴(yán)重，國(guó)內(nèi)外養(yǎng)牛業(yè)都因此遭受嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

目前，有多種實(shí)驗(yàn)室診斷方法用于病毒檢測(cè)，如病毒分離鑒定、常規(guī)PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和血清抗體中和試驗(yàn)等。試驗(yàn)人員通常采用ELISA 對(duì)BHV-1 和BVDV 抗體進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 進(jìn)行病毒分離鑒定以及PCR 檢測(cè)。但由于動(dòng)物感染病毒后機(jī)體產(chǎn)生抗體需要時(shí)間，因此抗體檢測(cè)不利于BHV-1和BVDV 急性感染和早期感染診斷。血清中和試驗(yàn)具有較高的特異性，但試驗(yàn)周期長(zhǎng)且操作繁瑣，對(duì)技術(shù)要求較高，對(duì)疫苗免疫過的動(dòng)物無法正確診斷，因此不適用于臨床樣品的大批量檢測(cè)。病毒分離鑒定是病原學(xué)診斷的常用標(biāo)準(zhǔn)方法，但病毒分離對(duì)環(huán)境要求比較高，需要在實(shí)驗(yàn)室規(guī)范進(jìn)行，沒辦法進(jìn)行批量臨床樣品檢測(cè)；病毒分離所需時(shí)間久、靈敏度不高且陽性率低，在運(yùn)輸過程中病毒容易失活從而導(dǎo)致檢出率降低。常規(guī)PCR 檢測(cè)方法所需時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟繁瑣，產(chǎn)物擴(kuò)增后還需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果準(zhǔn)確性低，容易導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性，污染環(huán)境。

本研究針對(duì)BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 的基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了能在同一體系中同時(shí)檢測(cè)BHV-1、BRSV、BPIV-3 和BVDV 的多重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法。該方法特異性強(qiáng)，可同時(shí)檢測(cè)BHV-1、BRSV、BPIV-3和BVDV；經(jīng)濟(jì)成本低，可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣品的大批量檢測(cè)；靈敏度高，BHV-1、BPIV-3 和BVDV最低可檢測(cè)到8.268 copies/uL，BRSV 最低可檢測(cè)到82.680 copies/uL，可對(duì)牛群中隱性感染或者持續(xù)帶毒宿主及發(fā)病動(dòng)物進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)；檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)且直觀可靠，檢測(cè)時(shí)間短，省時(shí)省力，反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增過程一步完成，熒光PCR 反應(yīng)時(shí)間僅需81 min，加上核酸樣品制備的時(shí)間，2 h 內(nèi)可得到檢測(cè)結(jié)果；重復(fù)性和穩(wěn)定性好，CV 幾乎低于1%，部分?jǐn)?shù)值從1%到2%不等；對(duì)生物安全水平要求低，整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)過程均在同一個(gè)封閉管內(nèi)進(jìn)行，可有效避免氣溶膠污染而造成的假陽性。

該方法適用于臨床對(duì)病原體進(jìn)行早期檢測(cè)，從而及時(shí)發(fā)現(xiàn)傳染源，分析了解相關(guān)疫病的流行情況。為保證養(yǎng)牛業(yè)快速、健康、穩(wěn)定發(fā)展，需加強(qiáng)對(duì)牛病毒病的診斷和防治研究。與病毒分離鑒定和常規(guī)PCR 擴(kuò)增相比，本研究建立的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法具有較高的實(shí)用價(jià)值，能有效節(jié)省時(shí)間，提高擴(kuò)增效率，為實(shí)際生產(chǎn)中快速鑒別診斷疫病提供技術(shù)支持，對(duì)牛病毒病防控有重要意義。