李梁珊 郭依俠 劉世國 王麗娜

[摘要]?目的 對一個中國漢族肺囊性纖維化（PCF）的家系進行基因測序分析，尋找可疑致病基因突變，探討疾病基因型和表型的關系。方法 提取先證者外周靜脈血全基因組DNA，利用全外顯子測序（WES）進行突變篩查，與1 000 genomes、dbSNP數據庫中人類基因組參考序列進行比對，尋找可疑基因突變位點，采用一代測序在先證者及其父母中進行驗證。結果 先證者反復咳嗽2.5年，根據其臨床表現、實驗室檢查結果和基因檢測結果確診為PCF。WES結果結合一代測序驗證顯示，病人的囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子（CFTR）基因存在兩處復合雜合突變（c.650A>G/p.E217G、c.1231A>G/p.K411E，分別遺傳自母親和父親），而在200例健康對照者中未發(fā)現該突變。結論 CFTR基因c.650A>G、c.1231A>G復合雜合突變很可能是PCF的致病突變位點。本研究結果對擴大CFTR的突變譜和PCF的臨床診斷及產前遺傳學篩查具有重要意義。

[關鍵詞]?囊性纖維化;肺疾病;囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子;突變;全外顯子組測序

[中圖分類號]?R563;R394.3

[文獻標志碼]?A

[文章編號]?2096-5532（2021）04-0503-04

囊性纖維化（CF）是一種白種人較常見的常染色體隱性單基因遺傳病，常累及肺、胰腺、肝臟、胃腸道及生殖系統(tǒng)等多器官系統(tǒng)[1]，肺部病變是CF病人主要的死亡原因[2]。其臨床特征具有異質性，主要的臨床表現為咳嗽、咳痰、氣管重塑、黏液堆積、胰腺功能不全、營養(yǎng)不良、汗液電解質異常升高、男性不育等[3-5]，有的病人還會出現其他并發(fā)癥，如糖尿病、鼻竇炎、慢性代謝性堿中毒、肝大和肝硬化等表現[6-7]。CF病人診斷根據是典型的臨床表現、CF家族史、汗液試驗和基因突變檢測結果等。

囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子（CFTR）是目前已知的CF致病基因，定位于Chr7q31.2，長188 kb，它含有27個外顯子，編碼含有1 480個氨基酸的CFTR蛋白。自RIORDAN[8]在1989年發(fā)現該基因以來，CFTR基因的結構、功能和突變對蛋白的影響已經得到了深入研究。CFTR是一種環(huán)磷酸腺苷（cAMP）依賴的氯離子通道蛋白[9]，控制氯離子和碳酸氫鹽離子進出細胞[10]，表達于氣道、肺、消化道和生殖道等多部位上皮細胞的頂膜[11]。CFTR缺失或功能障礙可導致氯離子轉運功能異常、鈉離子通道調節(jié)受損，使得陰離子分泌減少，鈉離子和水重吸收增加，導致汗液和黏性分泌物中鹽離子濃度增加，分泌物黏稠，從而堵塞不同的器官系統(tǒng)[7，12]。至今已有2 000多個CFTR基因突變被報道[11]，但是CF基因型和表型之間的關系仍然不夠明確，有待進一步研究。

作為一種高通量的基因測序技術，全外顯子測序（WES）具有成本效益高、準確性較高、測序時間短等優(yōu)勢，現已成為臨床上診斷單基因遺傳病的重要輔助手段。本研究報告一個肺囊性纖維化（PCF）家系，因家系比較小，臨床表現單一，父母均未出現相似癥狀，很難對先證者做出準確診斷并判斷可疑致病基因，所以本研究聯(lián)合采用WES和Sanger測序驗證技術篩查并確定可疑致病基因突變位點，探討疾病基因型和表型的關系。

1?對象和方法

1.1?研究對象

病兒，女，8歲。3年前因反復咳嗽入院治療。病兒反復咳嗽，活動后加重，有痰不易咳出，無咯血，無發(fā)熱，支氣管鏡見大量白色黏痰，無胰腺、腸道、汗腺、肝臟及鼻竇等其他外分泌腺異常表現。既往有卵圓孔未閉史和哮喘史。體格檢查：神志清，口唇無發(fā)紺，雙肺呼吸音粗，未聞及哮鳴音，雙下肺聞及少許濕啰音，心律齊，無雙下肢水腫。行基因檢測后確診為PCF。病兒無兄弟姐妹，父母既往體健，無明顯PCF癥狀，否認家族遺傳史。本研究經青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2?研究方法

1.2.1?外周血DNA提取?獲得家系各成員的書面知情同意后，采集先證者及其父母的外周靜脈血各3 mL，同時采集200例來自山東的健康對照者外周靜脈血各3 mL。采用Tiangen DNA提取試劑盒提取外周血全基因組DNA，嚴格按照說明書要求進行操作。

1.2.2?WES?將基因組DNA用超聲波隨機打斷成長度為180～280 bp的片段，向純化后的DNA片段中加入末端補齊體系和多聚核苷酸激酶（PNK）進行末端修復反應，經過Agencourt AMpure XP磁珠純化，得到5′端含有磷酸基團的平末端DNA短片段文庫。在已修復DNA片段的3′末端加上A堿基，并將Illumina測序接頭連接至文庫DNA兩端。行PCR反應有效富集兩端都連有接頭的DNA片段。使用Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進行全外顯子雜交捕獲，從而捕獲到基因的外顯子，然后應用PCR擴增外顯子DNA文庫。完成橋式PCR之后，利用Illumina平臺PE150（Pair end 150 bp）上機測序，目標區(qū)平均深度為111.360，目標區(qū)覆蓋度為99.90%，并應用生物信息專業(yè)軟件分析測序數據。與1 000 genomes、dbSNP數據庫中人類基因組參考序列進行比對，尋找可疑的基因突變位點。

1.2.3?Sanger測序驗證?將WES篩查到的可疑致病突變在先證者及其父母和200例健康對照者中進行Sanger測序驗證。對突變位點所在外顯子序列進行PCR擴增，用Primer premier 5軟件設計引物。PCR反應體系為20 μL，包括Master Mix 10 μL，上游、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。擴增完成后，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，若條帶明亮且單一，則使用ABI3730XL測序儀（Applied Biosystems）對PCR產物進行測序。與NCBI（National Center Biotechnology Information）網站上的標準序列進行比對，找出突變位點。

2?結?果

2.1?遺傳學分析

WES遺傳學分析表明，先證者存在兩處錯義突變（c.650A>G/p.Glu217Gly和c.1231A>G/Lys411Glu）分別位于CFTR基因的第6外顯子和第10外顯子，c.650A>G導致217位的谷氨酸變成甘氨酸，c.1231A>G導致賴氨酸在411位變成谷氨酸。Sanger測序驗證表明，母親存在一處c.650A>G/p.Glu217Gly雜合突變，父親則是c.1231A>G/Lys411Glu雜合子攜帶者，先證者的兩處復合雜合突變分別來自父親和母親。這兩處突變均未在200例健康對照個體中檢測到，表明變異在該家族中存在共分離現象。見圖1。查閱相關文獻和數據庫，先證者的復合雜合突變在國內系首次報道。

2.2?生物信息學分析

從NCBI網站中獲得人、牛、狗、家貓、小家鼠、兔、黑猩猩、豬的CFTR蛋白序列，并用DNAMAN軟件進行多重序列比對。生物信息學的分析結果顯示，突變c.650A>G位于CFTR蛋白的非保守序列

3?討?論

CF是由CFTR基因突變導致的一種外分泌腺功能異常的常染色體隱性遺傳病，可累及全身多個器官系統(tǒng)，預后不良。該病以肺部持續(xù)炎癥和反復感染、生長發(fā)育遲緩、脂肪和蛋白質吸收不良、不孕不育、慢性肝病等為主要特征[5-6，12-13]，其中肺和氣道表現是CF最顯著的臨床表現[10]。

本研究通過WES結合Sanger測序驗證的方法，在PCF病人CFTR基因的第6外顯子和第10外顯子發(fā)現了兩處復合雜合突變（c.650A>G/p.Glu217Gly和c.1231A>G/Lys411Glu），而在200例健康對照者中均未發(fā)現這兩處突變，突變位點在該家系中共分離。LEE[14]研究證實，Glu217Gly突變降低了膜蛋白表達和陰離子轉運活性的60%～70%，而Lys411Glu突變被NAKANO等[15]預測為有害變異。雖然這兩個突變均曾被論述過對蛋白質的結構和功能有較大的影響，但由于本研究未行功能學驗證，因此只能認為這兩處突變是先證者PCF的高度可疑致病突變。

CFTR基因位于Chr7q31.2的長臂上，由27個外顯子組成，全長約188 kb，在上皮細胞表面表達，編碼由1 480個氨基酸組成的CFTR蛋白（氯離子通道蛋白）。CFTR蛋白是ATP結合盒（ABC）轉運蛋白超家族中的一員，由5個結構域組成：包括2個跨膜結構域TMD1/TMD2、1個調控域R（為磷酸化位點）和2個核苷酸結構域NBD1/NBD2[4，10，16]。

CFTR蛋白可以促使氯離子通過黏液產生于上皮細胞的頂膜，但是CFTR突變會影響該蛋白的合成和功能，導致上皮細胞對氯離子的通透性降低、鈉離子重吸收增加，造成黏液黏稠和汗液氯離子濃度異常增高，厚厚的黏液在不同的器官中堆積，使黏液腺導管堵塞，進而引起外分泌腺功能障礙[7，14]。

根據CFTR的截斷或缺乏、結構和功能，CFTR突變可分為6大類。Ⅰ類突變是由于移碼突變或錯義突變出現新的終止密碼子，影響蛋白的生物合成，產生縮短的功能缺陷的CFTR[7，17]。Ⅱ類突變導致CFTR折疊或成熟障礙，致使缺陷的CFTR在內質網被提前降解而不能被運輸至頂膜處[4]，其中最常見的突變是F508del[7，18]。Ⅲ類突變改變CFTR的調節(jié)，導致蛋白活性降低，使CFTR與ATP結合不能正常進行，從而影響通道的激活[17]。Ⅳ類突變導致蛋白傳導異常。CFTR通道能打開及關閉，但是由于電傳導缺陷，導致氯離子的轉運功能降低[18]。Ⅴ類突變是RNA剪接異常，使功能正常的CFTR數量減少[16，19]。Ⅵ類突變導致CFTR蛋白的C-末端異常，影響成熟蛋白的穩(wěn)定性，但CFTR的功能和數量均正常[7，9]。因未進行進一步的蛋白功能學驗證，故不能證實本研究發(fā)現的兩處錯義突變屬于哪一類CFTR突變。

總之，CF是一種累及多系統(tǒng)的復雜疾病，具有臨床異質性，在中國的發(fā)病率很低，對該病進行準確診斷還需借助基因測序技術。隨著技術的發(fā)展，具有準確、高通量、性價比高等特點的WES在單基因遺傳病的檢測和診斷中取得了豐碩的成果，可為遺傳病的明確診斷、個體化治療、遺傳咨詢和產前篩查等提供依據，具有廣闊的臨床應用前景。本研究結果不僅為CF的臨床診斷和產前篩查提供了依據，也為CF致病機制和治療方案的進一步研究奠定了堅實的基礎。

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（本文編輯?馬偉平）