陳霞，張潔，董瑞（成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045）

伊班膦酸鈉，化學名稱為1-羥基-3-（N-甲基-戊胺基）-亞丙基二膦酸-鈉鹽-水合物，臨床上用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、惡性腫瘤溶骨性骨轉(zhuǎn)移以及伴有或不伴有骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤引起的高鈣血癥，目前的劑型為注射液[1-4]。該藥物的最后一步合成中，通常會產(chǎn)生諸如亞磷酸根、磷酸根、1-羥基-3-戊胺基-亞丙基二膦酸、1-羥基-3-甲胺基-亞丙基二膦酸等雜質(zhì)[5-6]。伊班膦酸鈉和這些雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)皆沒有發(fā)色基團，也不具備電化學活性，故不能用常規(guī)的紫外、熒光或電化學分析方法檢測。目前報道伊班膦酸鈉及伊班膦酸鈉注射液中有關(guān)物質(zhì)檢測方法的文獻較少，且未見同時檢測N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、亞磷酸、雜質(zhì)B、雜質(zhì)D、磷酸、雜質(zhì)G、N-去甲基雜質(zhì)，并能排除氯離子、碳酸根、硫酸根干擾的報道[7-15]。本文建立了離子色譜抑制法同時測定伊班膦酸鈉原料藥中7 個有關(guān)物質(zhì)的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

離子色譜儀Thermo IC5000，包括自再生抑制器（Dionex AERS 500），電導檢測器，進樣器（Dionex AS-DV）；十萬分之一天平（MS205DU METTER TOLEDO），超純水儀（Milli-Q）。

1.2 試藥

對照品伊班膦酸（USP，批號：R013F0，純度：99.9%）；N-去甲基雜質(zhì)（批號：20161002-D，純度：100%）、雜質(zhì)G（批號：20181004-D，純度：100%）、雜質(zhì)D（批號：D-181101，純度：100%）（A 制藥股份有限公司）；雜質(zhì)B（TLC，批號：2641-091A3，純度：99.4%）；N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽（成都叮當時代科技有限公司，批號：DTYQ0605-13-D，純度：100%）；亞磷酸、磷酸（中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Dionexionpac AS11-HC 色譜柱（4 mm×250 mm，9 μm）；AG11-HC 保護柱（4 mm×50 mm）；以100 mmol·L－1NaOH 為流動相A、水為流動相B，梯度洗脫（見表1）；流速：1.0 mL·min－1；檢測器：抑制性電導檢測器；檢測器溫度：35℃；抑制器：Dionex AERS 500 4 mm；抑制器電流：110 mA；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液 取伊班膦酸原料藥，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含伊班膦酸鈉5 mg 的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液 取伊班膦酸鈉對照品和磷酸對照品各適量，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL 約含伊班膦酸5 mg、磷酸5 μg 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.3 混合對照品溶液 精密稱取伊班膦酸鈉對照品和N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、伊班膦酸N-去甲基、亞磷酸、磷酸對照品各適量，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL 約含伊班膦酸5 μg、N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽5 μg、伊班膦酸N-去甲基5 μg、亞磷酸10 μg、磷酸15μg 的溶液，作為混合對照品溶液。

2.3 專屬性考察

精密量取空白溶劑（超純水）、伊班膦酸鈉雜質(zhì)B、N-去甲基雜質(zhì)、雜質(zhì)G、雜質(zhì)D、N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、磷酸和亞磷酸適量，加超純水溶解作為對應(yīng)的定位溶液；取上述各溶液適量混合后作為混合定位溶液；另取樣品溶液加入混合定位溶液進樣20 μL，記錄色譜圖。見圖1，結(jié)果表明：溶劑不干擾已知雜質(zhì)和主成分的檢出；各已知雜質(zhì)之間、已知雜質(zhì)與主成分之間的分離度均符合要求。

圖1 專屬性考察圖譜Fig 1 Ion suppression chromatogram of specificity

2.4 強制降解試驗

為考察本品可能的降解途徑及擬訂色譜條件對降解產(chǎn)物的檢測能力，確定強制降解產(chǎn)物是否為已知雜質(zhì)，本研究對原料進行了強制降解試驗，樣品制備方法見表2。取上述各供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖，強制破壞試驗結(jié)果見表3及圖2。

圖2 伊班膦酸強制破壞試驗Fig 2 Forced degradation of ibandronate sodium

表2 強制降解條件Tab 2 Forced degradation condition

表3 強制破壞試驗結(jié)果Tab 3 Forced degradation

結(jié)果顯示，本品在酸、堿、氧、高溫和光照條件下均未產(chǎn)生較大未知雜質(zhì)，且破壞條件足夠強烈，遠遠超過本品儲存條件，故未繼續(xù)加劇破壞條件。且各破壞條件下，雜質(zhì)與主成分峰之間的分離度均大于1.5，表明擬訂的色譜條件能夠滿足各已知雜質(zhì)及降解產(chǎn)物的有效檢出及分離。

2.5 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）

精密量取“2.2”項下對照品混合液適量，逐級稀釋，以信噪比（S/N）約為3 時的進樣濃度為其檢測限（LOD），以信噪比（S/N）約為10 時的進樣濃度為其定量限（LOQ），并平行配制6 份進行檢測。

以擬訂供試品濃度5 mg·mL－1，進樣體積為20 μL 時，各雜質(zhì)的檢出能力均低于絕對進樣量的0.02%（限度的20%），各雜質(zhì)的定量限均小于報告限（本品的最大日劑量小于2 g，根據(jù)ICH的要求，原料有關(guān)物質(zhì)的報告限為0.05%）。

2.6 線性關(guān)系考察

按“2.2.3”項下方法配制每1 mL 約含伊班膦酸N-去甲基雜質(zhì)、雜質(zhì)B、雜質(zhì)D、雜質(zhì)G、N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸各50 μg、磷酸150 μg 和亞磷酸100 μg 的混合溶液，作為線性儲備液；精密量取線性儲備液逐級稀釋，制成系列雜質(zhì)線性溶液。精密量取上述各線性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表4。

表4 標準曲線、線性范圍、檢測下限和定量下限Tab 4 Regression equation，linearity，LODs and LOQs

2.7 精密度考察

量取對照品溶液按“2.1”項下方法測定，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖，考察進樣精密度，結(jié)果N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、亞磷酸、雜質(zhì)B、雜質(zhì)D、磷酸、雜質(zhì)G、N-去甲基雜質(zhì)色譜峰面積的RSD分別為0.34%、0.21%、3.0%、0.23%、0.17%、1.2%、0.40%，表明方法精密度良好。

2.8 重復(fù)性考察

按“2.10”項下方法配制100%的加標供試品溶液，平行配制6 份。照“2.1”項下色譜條件進行測定，計算每份樣品中已知雜質(zhì)的含量。結(jié)果N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽含量RSD為2.6%；亞磷酸的含量RSD為1.1%；雜質(zhì)B 的含量RSD為1.9%；雜質(zhì)D 的含量RSD為1.81%；N-去甲基雜質(zhì)的含量RSD為1.3%；磷酸的含量RSD為1.8%；雜質(zhì)G 的含量RSD為0.72%，說明擬定的檢測方法重復(fù)性符合要求。

2.9 穩(wěn)定性考察

參照“2.10”項下方法配制對照品溶液與加標供試品溶液，在室溫下放置不同的時間，進樣測定，考察各溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明室溫條件下，對照品溶液放置12 h，各雜質(zhì)峰面積RSD小于3.0%，穩(wěn)定性良好；供試品溶液放置12 h，各雜質(zhì)峰面積RSD小于3.0%，穩(wěn)定性良好。

2.10 回收試驗

取伊班膦酸鈉原料約50 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，分別精密加入“2.4”項下線性儲備溶液適量，制成含限度濃度50%、100%、150%的加標供試品溶液，每個濃度平行制備3 份，照“2.1”項下色譜條件進行檢測，結(jié)果N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、亞磷酸、雜質(zhì)B、雜質(zhì)D、磷酸、雜質(zhì)G、N-去甲基雜質(zhì)的平均回收率均在93.48%～100.30%，RSD在1.2%～5.5%。

2.11 樣品測定

取伊班膦酸鈉原料按照擬訂的檢測方法測定，結(jié)果見表5。

表5 伊班膦酸鈉中有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果Tab 5 Detection of related substances in ibandronate sodium

3 討論

伊班膦酸鈉原料藥中存在較多的陰離子，故采用梯度洗脫的方式，即改變流動相中氫氧化鈉溶液的濃度，使各雜質(zhì)之間、雜質(zhì)與主成分之間分離度均能達到要求；且在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，采用100 mmol·L－1NaOH-水（22∶78）等度洗脫，除雜質(zhì)G 外，其余各峰峰形和分離度良好；雜質(zhì)G 峰形一般且響應(yīng)較低；雜質(zhì)D 峰拖尾；故用梯度優(yōu)化雜質(zhì)G 的峰形。氫氧化鈉溶液的濃度梯度由初始的16 mmol·L－1增加至45 mmol·L－1時，各雜質(zhì)與主峰間能夠達到分離要求，各陰離子峰之間均無干擾。

本文采用陰離子交換-抑制電導方式進行檢測，不僅可以得到很低的背景電導，提高檢測靈敏度，而且樣品前處理簡單，只需溶解稀釋即可進樣分析。