徐雙華，吳清（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京中京豐創(chuàng)科技有限公司，北京 100070）

骨質(zhì)疏松癥是一種內(nèi)分泌、營(yíng)養(yǎng)、免疫、遺傳多種復(fù)合因素引起的代謝性疾病，大部分患者屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松，主要是因年齡增加所致，在老年人、絕經(jīng)后婦女和惡性腫瘤患者中發(fā)生率較高。因此，研究防治骨質(zhì)疏松的藥物極為重要。

研究表明，肉蓯蓉能提高性激素水平[1-2]、促進(jìn)骨形成[3-5]、抑制骨吸收[6]；菊粉可以增加鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)與磷的生物利用度、提高鈣吸收與全身骨骼礦物質(zhì)參數(shù)[7-8]；硫酸軟骨素能促進(jìn)成骨細(xì)胞增生和新骨形成[9]。本研究將肉蓯蓉、菊粉與硫酸軟骨素組成復(fù)方制劑，研究以去卵巢所致骨質(zhì)疏松大鼠為對(duì)象，觀察由上述復(fù)方制劑增加動(dòng)物骨密度及相關(guān)蛋白表達(dá)的效果，為治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用提供依據(jù)。

1 材料

肉蓯蓉（經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定為肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma），菊粉（比利時(shí)BENEO ORAFTI），硫酸軟骨素鈉片（四川省尚善堂制藥有限公司），注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司），戊酸雌二醇（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司），骨鈣素（BGP）試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司），堿性磷酸酶（ALP）ELISA 試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司），BMP-2 抗體（北京四正柏生物科技有限公司，4AK201716F），組織蛋白酶K（CK）試劑盒（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司），脫氧吡啶啉（DPD）ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海研域儀器設(shè)備有限公司），白細(xì)胞介素-6（IL-6）檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），戊巴比妥鈉（德國(guó)默克公司，批號(hào)：20160411），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（上海穎心實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：TX20149）。NORLAND-Stratec 周圍型雙能X 線骨密度儀（北京邁爾思瀛海威醫(yī)療技術(shù)有限公司）；離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

Wistar 大鼠[北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，SPF 級(jí)健康雌性大鼠，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)：SYXK（京）2010-0025]，體質(zhì)量（300±20）g。所有動(dòng)物均放置于恒溫、清潔的環(huán)境中。溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（65±5）℃，光照12 h，黑暗12 h，動(dòng)物自由攝食、攝水。

2 方法

2.1 肉蓯蓉復(fù)方顆粒的制備

肉蓯蓉200 g，粉碎，按照料液比1 ∶20 加入提取液（70%乙醇），在50℃條件下，提取時(shí)間為50 min，重復(fù)提取兩次，提取液回收溶劑并濃縮，烘干得到肉蓯蓉浸膏，與300 g 菊粉、硫酸軟骨素25 g 混合均勻后，通過(guò)傳統(tǒng)的濕法制粒制成顆粒。

2.1 大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立

將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6個(gè)組，每組10只，分別為假手術(shù)組（0.5%CMC-Na，10 mL·kg－1），去卵巢模型組（0.5%CMC-Na，10 mL·kg－1），戊酸雌二醇陽(yáng)性對(duì)照組（1 mg·kg－1），肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中、低劑量組1100、550、275 mg·kg－1（給藥劑量分別為處方劑量的2 倍、1 倍、0.5 倍）。

手術(shù)前稱重，按照30 mg·kg－1劑量，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉溶液實(shí)施麻醉，待大鼠麻醉起效后，腹位固定后于腹中線距陰道口3～4 cm 除去毛，分別用碘酒和酒精消毒，待稍干后切開(kāi)皮膚和腹肌約2～3 cm，切口視野可見(jiàn)白色脂肪，撥開(kāi)脂肪層找到子宮后，輕輕將一側(cè)子宮角拉出，在其末端可見(jiàn)被脂肪團(tuán)包裹的卵巢，然后將卵巢下端輸卵管用絲線結(jié)扎，切除雙側(cè)卵巢，順勢(shì)將子宮角送回腹腔中，同法剪除另側(cè)卵巢。其中假手術(shù)組僅僅切除卵巢附近的部分脂肪組織，不結(jié)扎輸卵管、不切除卵巢，縫合切口，再次消毒，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉，1 次·d－1，連續(xù)3 d，防止術(shù)后感染。術(shù)后大鼠的活動(dòng)正常。術(shù)后觀察7 d，然后開(kāi)始每日下午灌胃給予對(duì)應(yīng)藥物，每周稱重一次，12 周后大鼠灌胃結(jié)束。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 體質(zhì)量 每周測(cè)定大鼠體質(zhì)量一次，據(jù)此調(diào)整灌胃量。

2.2.2 股骨干質(zhì)量測(cè)定 大鼠喂養(yǎng)12 周后處死，剝離出左、右股骨。取左側(cè)股骨于105 ℃烤箱中烤至恒重，稱定股骨干質(zhì)量。

2.2.3 骨密度測(cè)定 用美國(guó)NORLAND-Stratec周圍型雙能X 線骨密度儀（PDEXA）測(cè)定右側(cè)股骨重點(diǎn)及股骨遠(yuǎn)心端的BMD 值（g·cm－2）。

2.2.4 大鼠血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6和TNF-α的測(cè)定 給藥12 周后，麻醉大鼠，腹部下部開(kāi)口，暴露腹主動(dòng)脈，使用一次性采血針與配套的采血管，與腹主動(dòng)脈下部Y 字岔口處進(jìn)針取血，每只大鼠約取5 mL 全血。室溫靜置4 h，使血液完全凝固，3500 r·min－1離心10 min，取血清。按照試劑盒說(shuō)明，測(cè)定血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6 和TNF-α水平。

2.2.5 BMP-2 表達(dá)的測(cè)定 留取完整的右股骨段，并迅速投入液氮中，后轉(zhuǎn)移至－80℃保存，用于提取蛋白；用裂解液超聲提取總蛋白后，Western blot 法測(cè)定BMP-2 表達(dá)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用方差分析方法，均以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量及骨參數(shù)變化

如表1所示，相比較于模型組，肉蓯蓉復(fù)方顆粒高劑量組、中劑量組（P＜0.01，P＜0.05）大鼠體質(zhì)量增加量顯著降低，表明肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組對(duì)雌激素缺失導(dǎo)致骨髓間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞，具有良好的抑制作用，其中肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組股骨干質(zhì)量、BMD顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），表明肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組具有提高大鼠BMD及股骨干質(zhì)量的作用。

表1 肉蓯蓉復(fù)方顆粒對(duì)骨參數(shù)的影響Tab 1 Effect of cistanche compound granules on the bone parameters

3.2 大鼠血清指標(biāo)變化

3.2.1 血清中ALP、BGP 水平 如表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠由于雌激素的缺失會(huì)代償性增加ALP 和BGP 的分泌，其在血清中含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組大鼠血清ALP 和BGP 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明高、中劑量肉蓯蓉給藥組能夠有效地逆轉(zhuǎn)ALP 和BGP升高的趨勢(shì)，起到治療骨質(zhì)疏松的作用。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的ALP（P＜0.05）和BGP 顯著降低（P＜0.01）。

表2 肉蓯蓉復(fù)方顆粒對(duì)血清ALP、BGP 的影響Tab 2 Effect of cistanche compound granules on serum ALP and BGP

3.2.2 血清中CK 和DPD 含量變化 如圖1所示，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組的CK 和DPD 酶活力水平顯著性降低（P＜0.05，P＜0.01），肉蓯蓉復(fù)方顆粒通過(guò)抑制CK 和DPD 酶的活力，從而抑制骨吸收。

圖1 肉蓯蓉復(fù)方顆粒對(duì)組織蛋白酶（A）和DPD（B）的影響Fig 1 Effect of cistanche compound granules on serum CK（A）and DPD（B）

3.2.3 血清中IL-6 和TNF-α含量變化 如圖2所示，與模型組比較，肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組的IL-6、TNF-α水平減少（P＜0.01），抑制水平接近陽(yáng)性對(duì)照組，表明肉蓯蓉復(fù)方顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6、TNF-α的表達(dá)，降低破骨細(xì)胞增殖，抑制骨吸收。

圖2 肉蓯蓉復(fù)方顆粒對(duì)IL-6（A）及TNF-α（B）的影響Fig 2 Effect of cistanche compound granules on serum IL-6（A）and TNF-α（B）

3.3 大鼠BMP-2 蛋白表達(dá)

如圖3所示，骨組織中可檢測(cè)到BMP-2 蛋白表達(dá)，模型組的蛋白條明顯低于假手術(shù)組，說(shuō)明去勢(shì)大鼠的BMP-2 表達(dá)減少，肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組BMP-2 蛋白表達(dá)高于模型組，接近陽(yáng)性對(duì)照組，說(shuō)明肉蓯蓉復(fù)方顆粒可增強(qiáng)BMP-2蛋白表達(dá)，其中中劑量組的效果最好。

圖3 各組大鼠骨組織中BMP-2 蛋白表達(dá)圖Fig 3 Expression of BMP-2 protein in the bone tissues of rats in different groups

4 討論

去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型是研究動(dòng)物骨質(zhì)疏松采用的一種模型，去卵巢大鼠是研究絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的一個(gè)常用動(dòng)物模型，具有手術(shù)簡(jiǎn)單，重復(fù)性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[10]。因此，采用此模型能比較客觀地評(píng)價(jià)肉蓯蓉復(fù)方顆粒對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用。

在肉蓯蓉復(fù)方顆粒對(duì)骨參數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠骨密度明顯下降，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞無(wú)法保持平衡，骨量快速丟失。通過(guò)肉蓯蓉復(fù)方顆粒進(jìn)行治療后，可顯著提高骨密度、股骨干質(zhì)量，改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的狀態(tài)，抑制骨量的繼續(xù)丟失。

ALP 作為成骨細(xì)胞分泌物，其與血液中的鈣離子相互作用，促進(jìn)骨質(zhì)的合成，可反映成骨細(xì)胞的活性[1，11]，ALP 促進(jìn)有機(jī)磷酸化合物分解為無(wú)機(jī)磷酸離子，使磷酸離子與鈣離子結(jié)合沉淀于骨內(nèi)，BGP 也是由成骨細(xì)胞分泌，是骨形成和骨重建的反映指標(biāo)之一[12-13]，兩者均可反映成骨細(xì)胞的活性[14-15]，ALP 和BGP 水平越高，說(shuō)明體內(nèi)越缺鈣[16]。本研究中，通過(guò)手術(shù)去卵巢處理，構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠ALP 和BGP 含量升高，而肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組可顯著降低其含量，說(shuō)明肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量可以有效調(diào)節(jié)骨代謝平衡，抑制骨吸收，治療骨質(zhì)疏松。

BMP2/Smad 信號(hào)通路可以調(diào)控成骨細(xì)胞的全部過(guò)程，其功能障礙會(huì)引起骨量降低和骨形成減少，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[17]。BMP2 是經(jīng)典BMPs/Smad 通路的重要配體[18-20]，BMP2 是BMPs 家族中非常重要的一個(gè)亞型，其可以刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞，是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的重要的信號(hào)分子之一[21-23]。本研究中，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的BMP-2 蛋白表達(dá)明顯降低，說(shuō)明BMP2/Smad 通路的信號(hào)傳遞減弱，影響成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而影響骨密度水平，肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組可以上調(diào)BMP-2 蛋白水平，蛋白表達(dá)水平接近陽(yáng)性對(duì)照組，進(jìn)而調(diào)節(jié)BMP2/Smad通路的信號(hào)傳遞，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，起到治療骨質(zhì)疏松的作用。

CK 是組織蛋白酶溶酶體蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶成員。它被認(rèn)為可降解骨基質(zhì)蛋白，骨橋蛋白和骨粘連蛋白[24]，血清中的CK 是骨吸收的典型標(biāo)志物[25]，其過(guò)度表達(dá)會(huì)增加松質(zhì)骨轉(zhuǎn)換，阻止CK 表達(dá)可抑制骨吸收，有利于骨基質(zhì)的穩(wěn)定性[26]。DPD 也是典型的骨吸收標(biāo)志物[27-28]，當(dāng)骨吸收作用增強(qiáng)，成熟的Ⅰ型骨膠原分解，DPD 作為降解產(chǎn)物被釋放到血液中，DPD具有組織特異性，不受飲食影響，其只在骨吸收及骨溶解時(shí)才被釋放入血。因此，血清DPD 水平升高，說(shuō)明骨吸收增強(qiáng)[29]，本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的CK 和DPD 含量升高，說(shuō)明骨吸收增強(qiáng)，肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組可以顯著性降低CK 和DPD 含量，接近陽(yáng)性對(duì)照組，抑制骨吸收，從而有效對(duì)抗骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

細(xì)胞因子IL-6、TNF-α是調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵因素[30]，IL-6 作為一種生物活性因子，可通過(guò)多種方式參與到成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能調(diào)控，是促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化的重要因子[31]，IL-6 可以通過(guò)SHP2/P13K/Akt2 和SHP2/MEK/ERK 通路抑制成骨細(xì)胞分化，TNF-α是促進(jìn)骨吸收的細(xì)胞因子[32]，可作用于前體破骨細(xì)胞，使其分化為破骨細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，增強(qiáng)骨吸收。TNF-α還可通過(guò)影響OPG/RANKL/RANK 信號(hào)系統(tǒng)，以旁分泌的方式調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活化，刺激骨吸收[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的IL-6、TNF-α水平顯著升高，說(shuō)明模型組大鼠骨吸收增強(qiáng)，骨質(zhì)遭到破壞，而肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量組可顯著降低的IL-6、TNF-α水平，接近陽(yáng)性對(duì)照組水平，說(shuō)明肉蓯蓉復(fù)方顆粒高、中劑量可以抑制大鼠體內(nèi)IL-6、TNF-α的表達(dá)，通過(guò)影響SHP2/MEK/ERK、SHP2/P13K/Akt2 和OPG/RANKL/RANK 通路，降低破骨細(xì)胞增殖，抑制骨吸收，有效治療骨質(zhì)疏松。

近年來(lái)，許多研究證明補(bǔ)腎類中藥在治療老年性骨質(zhì)疏松癥的研究中取得了較滿意的結(jié)果，本方針對(duì)中老年人全身性骨量減少，骨密度損失及骨組織的微觀結(jié)構(gòu)退化所致的骨脆性增加、骨密度降低、骨折危險(xiǎn)性增加的特點(diǎn)，選用具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、補(bǔ)精益髓功效的肉蓯蓉，輔以具有促進(jìn)鈣和礦質(zhì)吸收，降低骨代謝過(guò)程作用的菊粉及促進(jìn)成骨細(xì)胞增生和新骨形成的硫酸軟骨素，有效改善了去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的狀態(tài)，為治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用提供依據(jù)。