滕龍飛，陳佳麗，周慶偉，王鎵

1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000

急性支氣管炎發(fā)病率較高，部分可遷延發(fā)展為慢性支氣管炎、肺氣腫、慢阻肺等多種慢性肺系疾病，加重患者及社會(huì)負(fù)擔(dān)。三拗片（SAP）為《太平惠民和劑局方》中三拗湯的加味方，在三拗湯基礎(chǔ)上加入生姜，由君藥麻黃、臣藥苦杏仁、佐藥生姜及使藥甘草4 味中藥構(gòu)成，具有宣肺解表、降氣平喘之功效。生姜具有解表散寒、溫肺鎮(zhèn)咳、溫中止嘔的功效，因此加強(qiáng)了原方溫肺散寒的功效，并能調(diào)和方中麻黃對(duì)胃腸道的刺激。SAP劑型為片劑，具有易于服用，方便攜帶、貯藏保管等特點(diǎn)，因此臨床應(yīng)用較多。中醫(yī)臨床研究發(fā)現(xiàn)，SAP 對(duì)于風(fēng)寒型急性支氣管炎有較好的療效[1]。陳麒等[2]研究表明，SAP對(duì)風(fēng)寒襲肺證急性支氣管炎患者的咳、痰、喘三大主癥具有明顯的改善作用，且無(wú)明顯不良反應(yīng)，其中痊愈占22.50%，顯效占51.25%。SAP 治療兒童急性支氣管炎療效明顯，不良反應(yīng)少[3]。中藥治療疾病具有多成分、多靶標(biāo)、多通路的特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)使得方藥作用于人體的機(jī)制研究更具整體性和系統(tǒng)性[4]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討SAP治療急性支氣管炎作用機(jī)制及其物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 SAP的主要化學(xué)成分及靶點(diǎn)檢索

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)吸收、分布、代謝、排泄（absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME）參數(shù)篩選口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18的SAP潛在活性成分及相應(yīng)的靶點(diǎn)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為基因名，最終得到SAP 潛在活性成分的靶點(diǎn)基因，建立數(shù)據(jù)集。

1.2 急性支氣管炎靶點(diǎn)基因獲取

以“Acute bronchitis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，獲得與急性支氣管炎相關(guān)的基因，重復(fù)基因僅保留1個(gè)。

1.3 SAP治療急性支氣管炎潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過Venny 2.1工具，將藥物潛在活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相映射，最終得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)，即為SAP作用于急性支氣管炎的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點(diǎn)（node）代表SAP 活性成分、預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，邊（edge）代表SAP活性成分與靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。選取度（degree）和介數(shù)中心性（betweenness）大于平均值的化合物用于分子對(duì)接。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將SAP 治療急性支氣管炎的作用靶蛋白導(dǎo)入STRING 11.5（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)拓?fù)浞治霭械鞍紫嗷プ饔藐P(guān)系，并利用Cytoscape 3.6.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)度值大小篩選排名前5的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，用于分子對(duì)接。

1.6 基因富集分析

運(yùn)用DAVID 6.8 對(duì)共同靶點(diǎn)所涉及的基因功能和相關(guān)通路進(jìn)行富集分析，并將其結(jié)果可視化。

1.7 分子對(duì)接

將1.4 項(xiàng)下主要活性成分通過TCSMP 數(shù)據(jù)庫(kù)下載MOL2 格式文件，通過AutoDockTools 1.5.6軟件加氫后作為配體保存成pdbqt 文件；通過PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載1.5 項(xiàng)下核心靶點(diǎn)PDB 格式文件，利用PyMOL 軟件刪除水和配體，通過AutoDock 軟件加氫后作為受體，保存成pdbqt 文件，利用AutoDock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接，篩選結(jié)合能最低的結(jié)構(gòu)為最優(yōu)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 SAP活性化合物及潛在靶點(diǎn)篩選

篩選出SAP 活性化合物共124 個(gè)，共預(yù)測(cè)靶點(diǎn)103 個(gè)；其中麻黃有效成分23 個(gè)、苦杏仁有效成分19個(gè)、甘草有效成分92個(gè)、生姜有效成分5個(gè)。

2.2 急性支氣管炎潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

檢索GeneCards、OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后共獲得急性支氣管炎潛在靶點(diǎn)863個(gè)。

2.3 SAP治療急性支氣管炎潛在作用靶點(diǎn)

將SAP化合物靶點(diǎn)和急性支氣管炎靶點(diǎn)取交集，共得到103 個(gè)共同靶點(diǎn)，即SAP 治療急性支氣管炎潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 SAP和急性支氣管炎靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建出成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，篩選出活性化合物7 個(gè)，度值從大到小依次為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、柚皮素（naringenin）、芒柄花黃素（formononetin）、甘草查耳酮A（licochalcone A），見圖2。

圖2 SAP治療急性支氣管炎的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果見圖3，共得到103 個(gè)節(jié)點(diǎn)、942條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為18.3，根據(jù)度值大小排名前5的核心靶點(diǎn)為細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、蛋白激酶B1（Akt1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA），度值分別為59、56、52、50、48。

圖3 SAP治療急性支氣管炎PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO及KEGG富集分析

共富集得到GO 生物學(xué)過程575 條、細(xì)胞組分54 條、分子功能85 條。以P＜0.05 為篩選條件，選取排名前10 的GO 條目繪制氣泡圖，見圖4，KEGG前10 條通路繪制氣泡圖，見圖5。其中在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、流感、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路、百日咳、p53信號(hào)通路、核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體信號(hào)通路等方面靶點(diǎn)富集較為集中。

圖4 SAP靶點(diǎn)的GO富集分析

圖5 SAP治療急性支氣管炎靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

2.7 分子對(duì)接

分子對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花黃素、甘草查耳酮A結(jié)合能均小于-5 kcal·mol-1（1 kcal·mol-1≈4.182 kJ·mol-1），均能較好地與急性支氣管炎靶蛋白結(jié)合，具體結(jié)合能信息見圖6。以上7 個(gè)活性化合物與Akt1 結(jié)合能的均值為-8.3 kcal·mol-1，是5個(gè)靶蛋白中最小值，因此Akt1 可能是SAP 治療急性支氣管炎的核心靶點(diǎn)。β-谷甾醇分子對(duì)接不能與靶蛋白殘基形成氫鍵，故排除，與Akt1 結(jié)合最好的為木犀草素，其次是槲皮素，分子對(duì)接模式見圖7。

圖6 SAP活性成分分子對(duì)接結(jié)合能熱圖

圖7 Akt1與木犀草素、槲皮素的分子對(duì)接

3 討論

急性支氣管炎是外界抗原感染所致的支氣管黏膜炎癥，發(fā)作以咳嗽、咯痰、喘息為特征，西醫(yī)臨床多從抗感染、止咳、平喘、祛痰等對(duì)癥治療為主，其治療方法單一且不良反應(yīng)多，急性期遷延不愈轉(zhuǎn)為慢性支氣管炎更為難治[5]。中西醫(yī)結(jié)合治療急性支氣管炎越來越得到認(rèn)可，大量研究證實(shí)了SAP 對(duì)于急慢性支氣管炎具有較好的臨床療效及安全性，相較于單純西醫(yī)治療，能夠明顯縮短病程、減少藥物不良反應(yīng)、提高免疫力、降低復(fù)發(fā)率[6-10]。本方源于《太平惠民和劑局方》中三拗湯，三拗來源于制法特點(diǎn)[11]：1）麻黃不去根、節(jié)。發(fā)汗而不過汗，麻黃莖

在上屬陽(yáng)，根在地下屬陰，正如肺之宣發(fā)肅降，一宣一降而復(fù)肺氣。2）杏仁不去皮、尖，留尖主發(fā)散，連皮主澀汗，也為發(fā)中有收。3）甘草不炙，取其補(bǔ)中有發(fā)。本方在三拗湯基礎(chǔ)上加入生姜1 味，加強(qiáng)了原方溫肺散寒、溫胃止嘔之功。

研究顯示，急性毛細(xì)支氣管炎的氣道炎癥細(xì)胞多為中性粒細(xì)胞，其對(duì)于機(jī)體防御和炎癥修復(fù)至關(guān)重要，而Akt1 又是中性粒細(xì)胞表達(dá)的重要亞型，在細(xì)菌感染或中性粒細(xì)胞被激活時(shí)下調(diào)，Akt1 的下調(diào)可減少中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，因此SAP 中的活性化合物可能通過下調(diào)Akt1 起到抗炎作用[12-14]。木犀草素和槲皮素能夠顯著地抑制促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 及IL-1β，表明木犀草素和槲皮素具有良好的體外抗炎效果[15]。槲皮素還是一種廣譜抗菌不易耐藥的植物抗生素[16-17]。山柰酚能夠通過抑制肺組織促炎因子核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、IL-1β、TNF-α表達(dá)，對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用。β-谷甾醇具有良好的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[18]。研究顯示，β-谷甾醇可防止肺組織氣道炎癥的發(fā)生[19]。柚皮素能通過NF-κB 顯著抑制炎癥細(xì)胞及介質(zhì)的釋放，減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥[20]。芒柄花素可增加小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫力[21]。甘草查耳酮A 可阻斷細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）/NF-κB 來抑制炎癥因子的表達(dá)，保護(hù)急性肺損傷小鼠[22]。PM2.5 觸發(fā)的呼吸系統(tǒng)炎癥可表現(xiàn)為VEGFA 顯著上調(diào)[23]，分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素、木犀草素、山柰酚等可能通過調(diào)控VEGFA改善氣道炎癥。

通過GO 生物學(xué)過程富集分析發(fā)現(xiàn)，SAP 治療急性支氣管炎可能涉及凋亡過程、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程，在急性支氣管炎的治療過程中起到關(guān)鍵作用。通過KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，SAP 主要活性成分靶點(diǎn)可能參與了PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、流感、MAPK信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、百日咳、p53 信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路，在急性支氣管炎的治療中發(fā)揮作用。人體免疫激活后，T 細(xì)胞分化釋放IL-6、TNF 等促炎因子進(jìn)行免疫[24]。抑制HIF-1α可以降低TNF-α和白細(xì)胞介素的表達(dá)，表明HIF-1α對(duì)促炎因子的分泌起關(guān)鍵作用。各種Toll 樣受體可調(diào)節(jié)病毒復(fù)制，進(jìn)而影響病毒的發(fā)病[25]。

綜上所述，SAP 治療急性支氣管炎的有效成分可能是槲皮素、山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花黃素、甘草查耳酮A 等，這些成分可能作用 于TP53、Akt1、IL-6、TNF、VEGFA 等 靶點(diǎn)，通過PI3K-Akt、TNF、流感、MAPK、Toll樣受體、HIF-1等多條信號(hào)通路，共同參與抗炎、平衡細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抑菌而起到治療作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初探SAP 治療急性支氣管炎的機(jī)制，但缺乏動(dòng)物及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，具有一定局限性，有待進(jìn)一步研究。