楊菲，張敏，劉蓉

研究顯示炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)的浸潤與心房顫動（房顫，AF）有關(guān)，炎癥涉及與房顫相關(guān)的各種病理過程（包括氧化應(yīng)激、纖維化和血栓形成）。最新研究顯示心房肌細(xì)胞的凋亡是引起房顫進(jìn)展的重要機(jī)制[1]。普羅布考是治療高膽固醇血癥的藥物，同時可抑制炎性反應(yīng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)對冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊呤褂闷樟_布考可預(yù)防心律失常的發(fā)生[2]，普羅布考是否可用于治療AF尚不清楚。p38MAPK通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥、增殖和凋亡的關(guān)鍵通路，研究顯示p38MAPK通路的激活會引起快速心房起搏和心臟的重構(gòu)[3]。本文分析普羅布考通過p38MAPK途徑對房顫動物模型心房肌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)理。

1 主要材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料SD大鼠（SPF級，雄性，220～250 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，中國）。氯化鈣和乙酰膽堿（Sigma公司，美國）。RM6240B/C小動物心電圖（RM6240B/C，鼠行生物科技，中國）。TUNEL和ELISA試劑盒（碧云天公司，中國）。組織勻漿機(jī)（Thermo Fisher Scientific公司，美國）。RIPA裂解緩沖液（中國，北京，Beyotime）。BCA試劑盒（武漢博斯特生物技術(shù)有限公司，中國）?？贵w購自美國Abcam公司。PVDF膜（Bio-Rad公司，美國）。顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 分組與建模36只大鼠隨機(jī)分為三組（每組各12只）：Sham組、AF組和AF+普羅布考組。AF組和AF+普羅布考組大鼠按參考文獻(xiàn)[4]建立AF模型，先配置AF誘導(dǎo)液（包括10 g/L的氯化鈣和33.66 mg/L的乙酰膽堿）。通過腹腔注射AF誘導(dǎo)液，劑量為0.1 ml/100 g，1/d，連續(xù)7 d。心電圖檢測建模情況（f波P波消失未出現(xiàn)AF）。AF+普羅布考組大鼠使用普羅布考灌胃，劑量50 mg/kg，2/d，連續(xù)7 d。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 心肌電生理水平大鼠處死后取出心臟，將心臟組織放置在Langendorff中靜置至自主節(jié)律穩(wěn)定，將氯化銀電極放在左心房檢測有效不應(yīng)期（ERP）和90%動作電位時程（APD90），ERP/APD90減小與AF有關(guān)。

1.3.2 TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡將心肌組織用4%的甲醛固定并用梯度醇脫水，包埋于石蠟中，制成厚度5 μm的玻片標(biāo)本，常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)處理，并用密封液封閉。將切片在37℃的蛋白酶K溶液（PH=7.5～8）中孵育并修復(fù)15 min，加入50 μl的TUNEL反應(yīng)溶液，37℃孵育1 h，使用PBST洗滌切片。加入100 μl的二氨基聯(lián)苯胺在37℃下孵育30 min后用PBST洗滌，在顯微鏡下觀察樣品。隨機(jī)選擇每個組織的四個視野進(jìn)行計(jì)算并收集平均值。凋亡指數(shù)=凋亡核數(shù)/（凋亡核數(shù)+正常細(xì)胞核數(shù)）×100%。

1.3.3 ELISA檢測炎性因子采集大鼠心臟中血液樣本，2000 rpm離心20 min后采上層血清，加入抗體和顯色劑，通過酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）濃度。

1.3.4 Western blot檢測p38MAPK通路將心肌組織裂解并提取總蛋白，通過BCA法計(jì)算濃度，將40 μg的總蛋白用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（90 V，90 min）分離。在100 mV的恒定電壓下將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將5%牛血清白蛋白加入到PVDF膜中，室溫下孵育1 h。將1:500稀釋的anti-MKK6、anti-p38MAPK添加到PVDF膜中，4℃孵育過夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h，加入ECL試劑盒顯影，GAPDH作為內(nèi)參，用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 普羅布考對AF大鼠模型心房肌電生理水平的影響AF組的ERP/APD90水平（0.39±0.05）顯著低于Sham組（0.69±0.06），P＜0.05，AF+普羅布考組的ERP/APD90水平顯著高于AF組（P＜0.05），表1。

表1 各組大鼠ERP/APD90水平比較

2.2 普羅布考對AF大鼠模型心房肌凋亡的影響AF組的凋亡指數(shù)（23.42±3.65 %）顯著高于Sham組（3.54±0.78%），P＜0.05，AF+普羅布考組的凋亡指數(shù)（9.42±1.26%）顯著低于AF組（P＜0.05），圖1。

圖1 TUNEL染色檢測普羅布考對AF大鼠模型心房肌凋亡的影響

2.3 普羅布考對AF大鼠模型炎性反應(yīng)的影響AF組的IL-6（13.75±2.89 pg/ml）和TNF-α（10.95±1.78 pg/ml）水平顯著高于Sham組（P＜0.05），AF+普羅布考組的IL-6（9.03±2.54 pg/ml）和TNF-α（7.21±2.93 pg/ml）水平顯著低于AF組（P＜0.05），表2。

表2 各組血清IL-6和TNF-α水平比較

2.4 普羅布考對AF大鼠模型p39MAPK通路的影響AF組心房肌細(xì)胞中MKK6和p38MAPK蛋白水平顯著高于Sham組（P＜0.05），AF+普羅布考組的心房肌細(xì)胞中MKK6和p38MAPK蛋白水平顯著低于AF組（P＜0.05），圖2。

圖2 Western blot檢測普羅布考對AF大鼠模型心房肌細(xì)胞中p39MAPK通路的影響

3 討論

房顫在人群中患病率為1%，80歲以上患者的患病率＞8%[5]。研究發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)是AF的發(fā)生和進(jìn)展的重要機(jī)制之一，炎性反應(yīng)不僅改變心房電生理和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致房顫的易感性增加，還會調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)和鈣相關(guān)的連接蛋白，或誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及纖維化。這些因素均會促進(jìn)心房結(jié)構(gòu)重塑，進(jìn)而影響心功能。

心肌細(xì)胞的凋亡與房顫有關(guān)，研究顯示miR-122的上調(diào)可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡參與房顫的發(fā)展[6]。普羅布考是一種雙酚化合物，具有降血脂、抗炎和抗氧化特性。本研究結(jié)果顯示對房顫大鼠使用普羅布考灌胃可明顯調(diào)節(jié)ERP/APD90水平，改善心肌細(xì)胞電生理；此外，TUNEL染色結(jié)果顯示普羅布考可顯著抑制AF大鼠心房肌細(xì)胞的凋亡。研究顯示房顫組的炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會直接導(dǎo)心房細(xì)胞凋亡并引起心房纖顫[7]，且在房顫中抑制心房肌細(xì)胞的凋亡是治療房顫，保護(hù)心功能的重要途徑[8]。提示普羅布考可通過抑制AF大鼠模型心房肌細(xì)胞凋亡改善心肌電生理，從而緩解房顫。

心肌梗死后p38MAPK通路的激活會通過促進(jìn)IL-6和TNF-α的表達(dá)引起房顫[9]。此外，激活的p38MAPK通路也是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制[10]。本研究結(jié)果顯示AF組的IL-6、TNF-α、MKK6和p38MAPK水平顯著高于Sham組，AF+普羅布考組的的IL-6、TNF-α、MKK6和p38MAPK水平顯著低于AF組。葉海波等[11]研究發(fā)現(xiàn)普羅布考可通過抑制p38MAPK抑制海馬神經(jīng)元凋亡。普羅布考也可通過抑制MAPK信號傳導(dǎo)緩解低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人腎近端腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[12]，提示普羅布考通過抑制p38MAPK通路抑制炎性反應(yīng)，減少AF大鼠模型的心房肌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，普羅布考通過抑制p38MAPK通路減少AF大鼠模型的心房肌細(xì)胞的凋亡，從而調(diào)節(jié)心肌電生理水平，提示普羅布考對于治療房顫具有積極的作用，但關(guān)于普羅布考調(diào)控p38MAPK通路的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。