王慧娟 喬 楊 張 敏 彭禮軍
1.西南藥食兩用資源開發(fā)利用技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州 興義 562400
太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm. 的干燥塊根,中醫(yī)臨床常用補(bǔ)益藥[1]。近年來(lái),人們對(duì)太子參化學(xué)成分進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究[2]。研究[3-6]表明,多糖是太子參的重要活性成份,具有抗應(yīng)激、抗氧化和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用,對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷和大鼠急性心肌梗死誘發(fā)的心肺損傷有一定的保護(hù)作用。
太子參多糖主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖等組成[7]。本研究在此基礎(chǔ)上,建立柱前衍生化-HPLC法測(cè)定太子參多糖中鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的含量,為太子參藥材質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的完善提供基礎(chǔ)。
Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司),F(xiàn)A2004型分析天平(上海良平儀器儀表有限公司),GZX-9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),恒溫水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)。
太子參藥材(貴州百靈制藥有限公司);1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);葡萄糖(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司,含量≥98.0%);半乳糖(solarbio公司,含量≥99.0%);鼠李糖(上海源葉生物科技有限公司,含量≥98.0%)、木糖(上海源葉生物科技有限公司,含量≥99.0%);醋酸銨、氯仿、氫氧化鈉、甲醇、濃鹽酸、三氟乙酸均為分析純,乙腈為色譜純。
2.1 液相色譜條件優(yōu)化
2.1.1 混合單糖對(duì)照品衍生化供試液制備 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖各100mg,加水溶解,定容至100 mL。
取對(duì)照品溶液1 mL,依次加入PMP甲醇溶液(0.5 moL·L-1)和NaOH溶液(0.2 moL·L-1)各0.5 mL,混勻,70 ℃水浴100 min,冷卻,加入鹽酸溶液(0.2 mol·L-1)中和,混勻,三氯甲烷洗滌3次,每次2 mL,取水層,離心后上清液用微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。
2.1.2 色譜柱選擇 分別采用waters C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)三種色譜柱,考察色譜柱對(duì)混合對(duì)照品衍生化供試液色譜峰的影響。結(jié)果表明,Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱能對(duì)各衍生化組分進(jìn)行很好地分離。具體如圖1所示。
1.waters C18 2.Agilent ZORBAX SB-C18 3.Agilent Eclipse XDB-C18
2.1.3 柱溫篩選 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱,設(shè)定柱溫為25 ℃,30 ℃和35 ℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn),柱溫越高,保留時(shí)間越短,出峰越快。為節(jié)約時(shí)間,選取柱溫為35 ℃。
2.1.4 流動(dòng)相考察 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱,設(shè)定流動(dòng)相為乙腈-水、乙腈-乙酸銨溶液(0.01 moL·L-1)、乙腈-乙酸銨溶液(0.02 moL·L-1)和乙腈-乙酸銨溶液(0.05 moL·L-1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙酸銨對(duì)峰形及分離度有改善作用,濃度越高,峰形對(duì)稱性越好,但對(duì)設(shè)備損傷較大。綜合考慮,流動(dòng)相選取乙腈-乙酸銨溶液(0.02 moL·L-1)。
2.2 太子參多糖水解方法篩選
2.2.1 水解用酸的考察 取6份太子參多糖(自制)各10 mg,加水1.0 mL溶解,分別加入3、5、7 moL·L-1鹽酸和1、3、5 moL·L-1三氟乙酸溶液各1.0 mL,混勻,110 ℃水解1 h,放冷,NaOH溶液中和,得太子參多糖水解液。
取上述6份多糖水解液各1.0 mL,照“2.1.1”項(xiàng)下處理后測(cè)定,其結(jié)果見表1。
表1 多糖酸水解后各單糖衍生物的峰面積
實(shí)驗(yàn)表明,不同水解條件下4種單糖峰面積變化趨勢(shì)并不相同。綜合考慮,水解用酸選擇3 moL·L-1鹽酸溶液。
2.2.3 水解溫度考察 取3份太子參多糖各10 mg,加水1.0 mL溶解,分別加入鹽酸(3 mol·L-1)1.0 mL,混勻,分別在100 ℃、110 ℃、120 ℃水解1 h,放冷, NaOH溶液中和,得太子參多糖水解液。
取上述多糖水解液各1.0 mL,照“2.1.1”項(xiàng)下處理后測(cè)定,根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果,水解溫度確定為110 ℃,其結(jié)果見表2。
表2 不同溫度水解多糖后各單糖衍生物的峰面積
2.2.4 水解時(shí)間考察 取3份太子參多糖各10 mg,加水1.0 mL溶解,加入鹽酸(3 moL·L-1)1.0 mL,混勻,于110 ℃分別水解30,60 和90 min,放冷, NaOH溶液中和,得太子參多糖水解液。
取上述多糖水解液各1.0 mL,照“2.1.1”項(xiàng)下處理后測(cè)定,根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果,水解時(shí)間確定為30 min,具體見表3。
表3 不同水解時(shí)間對(duì)單糖衍生物峰面積的影響
2.3 衍生化方法的篩選
2.3.1 衍生化溫度的篩選 取太子參多糖水解液3份,每份1.0 mL,置10 mL具塞試管中,依次加入PMP甲醇溶液(0.5 moL·L-1)和NaOH溶液(0.2 moL·L-1)各0.5 mL,混勻,分別于40 ℃,70 ℃,95 ℃水浴100 min,處理后進(jìn)樣測(cè)定。綜合考慮各單糖峰面積,將衍生化溫度確定為70 ℃,具體見表4。
表4 衍生化反應(yīng)溫度對(duì)單糖峰面積的影響
2.3.2 衍生化時(shí)間的篩選 取太子參多糖水解液3份,每份各1.0 mL,依次加入PMP甲醇溶液(0.5 moL·L-1)和NaOH溶液(0.2 moL·L-1)各0.5 mL,混勻,于70 ℃水浴分別加熱30,60和100 min,處理后進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)各單糖峰面積的大小確定衍生化時(shí)間為100 min,具體見表5。
表5 衍生化時(shí)間對(duì)單糖峰面積的影響
2.4 太子參藥材中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量測(cè)定
2.4.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.02 moL·L-1的乙酸銨溶液(19∶81);檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:10 μL。
2.4.2 供試品溶液的制備及測(cè)定 供試品溶液的制備 精密稱取太子參粉末0.2 g,置索氏提取器中,用80 mL乙醇回流提取1 h。過濾,濾渣揮干乙醇后,加水40 mL回流提取4 h,趁熱抽濾,再加水30 mL回流提取2 h,抽濾,合并濾液,定容至100 mL。精密吸取1 mL定容至10 mL,作為供試品溶液。
測(cè)定法:取太子參供試品溶液1 mL,加鹽酸溶液(3.0 moL·L-1)1 mL,混勻,110 ℃水解30 min,放冷,NaOH溶液調(diào)pH值至中性。取1 mL,依次加入PMP甲醇溶液(0.5 mol·L-1)和NaOH溶液(0.2 moL·L-1)各0.5 mL,混勻,70 ℃水浴加熱100 min,冷卻,鹽酸溶液(0.2 moL·L-1)中和后定容至5 mL,混勻,三氯甲烷洗滌3次,每次2 mL,取水層,離心后將上清液過濾,取續(xù)濾液,測(cè)定,即得。
2.4.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品液、供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖(見圖2)。從圖中可見,供試品溶液和對(duì)照品溶液中鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的保留時(shí)間一致,且供試品溶液中各待測(cè)峰的分離度符合要求。
A.混合單糖對(duì)照品溶液;B.供試品溶液
2.4.4 線性關(guān)系考察 取四種單糖濃度均為1 mg·mL-1的混合單糖對(duì)照品溶液,衍生化處理后測(cè)定,記錄色譜圖。以進(jìn)樣量x(μg)為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸得到四種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,見表6。
表6 四種單糖衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.4.5 精密度試驗(yàn) 取太子參藥材(1號(hào))0.2 g,按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試液,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定各單糖的峰面積,結(jié)果見表7。RSD均小于2%,表明儀器精密度良好。
表7 精密度試驗(yàn)結(jié)果
2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取太子參藥材(1號(hào))0.2 g,按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,結(jié)果見表8。
表8 重復(fù)性試驗(yàn)
2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取太子參藥材(1號(hào))0.2 g,按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液,分別于衍生化后0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果列入表9。RSD均小于2%,說(shuō)明供試液衍生化后在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
表9 穩(wěn)定性試驗(yàn)
2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測(cè)定含量的樣品(樣品編號(hào)1號(hào))各0.1g,置索氏提取器中,加乙醇回流提取1 h,濾渣揮干乙醇,再精密加入適量的鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖對(duì)照品,按照 “2.4.2”項(xiàng)下處理后測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表10~13。
表10 加樣回收率試驗(yàn)(鼠李糖)
2.4.9 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地的太子參藥材樣品,分別制備供試品溶液后測(cè)定,結(jié)果見表14。
表11 加樣回收率試驗(yàn)(葡萄糖)
表12 加樣回收率試驗(yàn)(半乳糖)
表13 加樣回收率試驗(yàn)(木糖)
表14 太子參藥材中各單糖含量測(cè)定結(jié)果
結(jié)果表明:各批次太子參的單糖含量懸殊不是很大,且皆呈現(xiàn)出同樣趨勢(shì):其含量木糖﹥半乳糖﹥鼠李糖﹥葡萄糖。各批次藥材中木糖和半乳糖含量均在10%以上,葡萄糖含量較低,大多在5%以下。
本文采用柱前衍生化-HPLC法對(duì)太子參藥材中的鼠李糖、葡萄糖、半乳糖以及木糖進(jìn)行測(cè)定,分別對(duì)液相色譜條件、多糖水解和衍生化條件進(jìn)行了優(yōu)化,比較了不同條件下單糖衍生物的峰形、分離度、峰面積大小變化等,最終確定了太子參藥材中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量測(cè)定方法。
對(duì)所建方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性均較好(回歸系數(shù)0.9999),精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于3%。在加樣回收率試驗(yàn)中,鼠李糖、半乳糖和木糖的平均回收率在95%~105%之間,且RSD﹤3%,符合要求。但葡萄糖的回收率偏低,平均值為86.04%,這可能與太子參藥材中葡萄糖含量較低且樣品前處理過程比較復(fù)雜有關(guān)。因此,在后續(xù)的太子參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作中,可優(yōu)先考慮將含量較高的鼠李糖、半乳糖和木糖納入質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
本文的研究工作,可為今后太子參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充完善提供研究基礎(chǔ)及數(shù)據(jù)支撐,對(duì)太子參的質(zhì)量控制具有一定的價(jià)值和意義。