李 軍 姜 華 張 寧 王 琦 陳雯雯 宋文博

河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)為山茱萸科山茱萸屬植物，為落葉喬木或灌木，集中分布于我國(guó)豫、陜、鄂、浙等省。生于海拔400～1500 m，的林緣或森林中。

山茱萸果實(shí)的果肉是一味常用中藥材，稱(chēng)之為山萸肉、棗皮等，中醫(yī)臨床用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)[2-5]證實(shí)山茱萸中的成分具有神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)、抗腫瘤、抗氧化等作用。山萸肉臨床用量較大，然而在加工過(guò)程中，剩余的果核基本是遺棄處理。這種做法不僅不利于環(huán)保，同時(shí)也造成很大的浪費(fèi)。因此，對(duì)山茱萸果核的再利用，就顯得尤為重要。文獻(xiàn)檢索顯示，山茱萸果核已經(jīng)被用來(lái)制備活性炭[6]、提取栲膠[7]等，然而這些方法對(duì)山茱萸果核的利用程度較低。

為了進(jìn)一步挖掘山茱萸果核的利用價(jià)值，前期對(duì)山茱萸果核中化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中含有較多的白樺脂酸和熊果酸。白樺脂酸具有鎮(zhèn)咳祛痰、清熱利濕、消腫解毒、提高機(jī)體免疫力、調(diào)血脂、抗腫瘤等作用[8]，熊果酸則具有殺蟲(chóng)、消炎、防流感、抗糖尿病等功能[9]。然而，目前未見(jiàn)有對(duì)于山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸含量測(cè)定的報(bào)道，這極大限制了山茱萸果核中該類(lèi)成分的利用?；诖?，本實(shí)驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸的方法，并采用該方法測(cè)定多個(gè)產(chǎn)地山茱萸果核的果殼果仁中白樺脂酸和熊果酸的含量。

1 材料

1.1 材料與試劑 白樺脂酸和熊果酸(購(gòu)自上海源葉生物科技公司)；山茱萸果核(南陽(yáng)西峽，洛陽(yáng)嵩縣的車(chē)村、舊縣、紙坊，洛陽(yáng)欒川的三川、冷水、叫河)，經(jīng)河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院路西明教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)成熟果實(shí)的果核；甲醇(DIKMA公司，色譜純)，重蒸水自制，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 Shimazu LC-15C高效液相色譜儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；電子分析天平(FA2004B型，上海佑科儀器儀表有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG101-3A型，鞏義予華儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 WondaSil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(80∶20∶0.08)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10.0 μL。在此色譜條件下，白樺脂酸和熊果酸分離度良好。

1.白樺酯酸；2.熊果酸

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取干燥至恒重的白樺脂酸和熊果酸對(duì)照品適量，置于同一10 mL 容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得白樺脂酸濃度為 0.21 g·L-1和熊果酸濃度為0.20 g·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取大小均勻的山茱萸果核適量，分離出果殼和果仁，粉碎，分別精密稱(chēng)取0.5 g，置于不同的容量瓶中，加甲醇10 mL，精密稱(chēng)重，然后超聲提取0.5 h，用甲醇補(bǔ)足至原重，混合均勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取取濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取白樺脂酸和熊果酸的對(duì)照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL注入液相色譜儀，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件記錄峰面積。以峰面積(Y×10-5)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得白樺脂酸和熊果酸的回歸方程分別為：Y=3.6246X-0.009(r=0.999 8)；Y=6.0447X-0.0723(r=0.999 8)。白樺脂酸和熊果酸的線性范圍分別為：0.42～4.2 μg,0.4～4.0 μg。

2.5 精密度考察 取南陽(yáng)西峽產(chǎn)山茱萸果核的果殼和果核粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，每次10.0 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果果殼和果核中白樺脂酸和熊果酸峰面積的RSD 值分別為1.1%、0.7%和1.8%、2.1%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取南陽(yáng)西峽產(chǎn)山茱萸果核的果殼和果核粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、10、12 h 進(jìn)樣，每次10.0 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果果殼和果核中白樺脂酸和熊果酸峰面積的RSD 值分別為1.5%、1.0%和0.8%、1.3%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性考察 取南陽(yáng)西峽產(chǎn)山茱萸果核的果殼和果核粉末5 份，每份0.5 g，精密稱(chēng)定，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10.0 μL 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果果殼中白樺脂酸和熊果酸含量的含量分別為4.29 mg·g-1、1.14 mg·g-1，RSD 值分別為0.7%、2.2%；果仁中白樺脂酸和熊果酸含量分別為3.80 mg·g-1、5.61 mg·g-1，RSD 值分別為2.0%，1.4%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率考察 精密稱(chēng)取已知含量的南陽(yáng)西峽產(chǎn)山茱萸果核的果殼和果核粉末各9 份，每份0.25 g，各分成3 組，每組3 份，以白樺脂酸和熊果酸含量的80%、100%、120%為梯度，分別精密加入各對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液制備方法操作，并進(jìn)樣。計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地的山茱萸果核，按照2.2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并依法測(cè)定，計(jì)算樣品中白樺酯酸和熊果酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，山茱萸果殼中白樺脂酸的含量范圍為3.65～5.34 mg·g-1，熊果酸的含量范圍為0.87～1.72 mg·g-1。山茱萸果仁中白樺脂酸的含量范圍為3.61～4.97 mg·g-1，熊果酸的含量范圍為4.88～7.46 mg·g-1。

表2 不同產(chǎn)地山茱萸果核中白樺酯酸和熊果酸含量分布 (mg·g-1

3 討論

白樺脂酸和熊果酸的結(jié)構(gòu)中均含有一個(gè)羧基，呈弱酸性，在中性的流動(dòng)相中可發(fā)生電離，在色譜柱分離過(guò)程中形成拖尾峰，影響分離效果，而在流動(dòng)相中加酸是抑制酸性成分電離的有效方法[10]。本實(shí)驗(yàn)中分別嘗試了磷酸和冰醋酸來(lái)調(diào)整流動(dòng)相的酸性，結(jié)果表明磷酸的效果較好，而冰醋酸的效果較差。至于磷酸的加入量，從0.01%開(kāi)始逐漸增加，發(fā)現(xiàn)隨著流動(dòng)相中磷酸含量的逐漸增加，白樺脂酸和熊果酸的峰形逐漸改善，其中白樺脂酸的效果尤為明顯。當(dāng)磷酸的含量增加到0.08%的比例時(shí)，白樺脂酸和熊果酸基本呈正態(tài)峰，且分離度良好，因此確定流動(dòng)相中磷酸的加入量為0.08%。

將白樺脂酸和熊果酸在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，該二成分均沒(méi)有最大吸收峰，在200～220 nm之間存在末端吸收。因此，將檢測(cè)波長(zhǎng)確定在210 nm。

表2中測(cè)定的結(jié)果顯示，山茱萸果殼中白樺脂酸的含量偏高，而在果仁中熊果酸的含量偏高。果殼樣品中白樺脂酸含量最高的是欒川叫河樣品，最低的為欒川三川的樣品。在山茱萸的果仁中，熊果酸的含量最高的是欒川三川和嵩縣車(chē)村樣品，最低的是嵩縣舊縣的樣品。

本實(shí)驗(yàn)建立的山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠，為山茱萸果核中白樺脂酸和熊果酸的利用奠定基礎(chǔ)。