陳雙龍 齊 麒 楊青素 范瑞娟

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

腦血管疾病為臨床常見病，其致殘率和死亡率明顯高于其他疾病，嚴(yán)重影響患者家庭生活水平，有研究者對中國31個(gè)省，20歲以上約48萬的成年人做調(diào)查，顯示其患病率為1.1148%，死亡率高達(dá)0.1148%[1]，給整個(gè)社會發(fā)展帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腦血管病成為當(dāng)今人類主要關(guān)注的問題。中醫(yī)認(rèn)為，中風(fēng)和瘀血是腦血管病的常見病理因素。小續(xù)命湯和桃紅四物湯分別具有扶正祛風(fēng)和活血除瘀的療效，是治療腦血管病的經(jīng)典方劑。有研究[2]發(fā)現(xiàn)小續(xù)命湯治療腦卒中可促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，桃紅四物湯對神經(jīng)元損傷改善效果顯著[3]。但兩方聯(lián)合治療同一種疾病的相關(guān)研究較少，本實(shí)驗(yàn)選取上述兩方合用，對大鼠腦缺血再灌注損傷模型進(jìn)行干預(yù)，觀察兩方的療效差別及是否存在協(xié)同作用，以期為腦血管疾病的治療提供新思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取120只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±30)g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(軍)2012-0011]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材 本實(shí)驗(yàn)藥材均購自北京同仁堂(貴陽分店)。桃紅四物湯《醫(yī)壘元戎》：由桃仁、紅花、熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎組成，按原方比例濃縮成生藥濃度為2.1 g·mL-1的水煎液。小續(xù)命湯原方見于(唐·孫思邈《備急千金要方》)：由麻黃、桂枝、白芍、川芎、黃芩、杏仁、附子、甘草、人參、防己、防風(fēng)、生姜組成以原比例配藥制為水煎劑，用蒸餾水調(diào)藥物濃度至1.5 g·mL-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 TTC染色液(北京索萊寶科技有限公司，批號：T8170)；MCAO拴線(北京西濃科技有限公司，批號：2634-50A4)；4%多聚甲醛固定液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號：20180112)；PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：ZLI-9062)；無水乙醇(江蘇海興化工有限公司，批號：GB678-90)；蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：BA-4097)；鹽酸(成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，批號：20180118)；中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20171009)；重鉻酸鉀(成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，批號：20180120)；濃硫酸(成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，批號：20180119)；APES(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9001)；CPBS(0.01 M PH6.0)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9064)；氯托洛寧(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號：180118)；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(上海聚慕醫(yī)療器械有限公司，型號：徠卡-2016)；全自動封閉式組織脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司，型號：TSJ-Ⅱ)；包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠，型號：BMJ-Ⅲ)；病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司，型號：PHY-Ⅲ)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號：BA400Digital)；圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司，型號：Image-Pro Plus 6.0)。

2 方法

2.1 動物造模 按改良版Longa線栓法制備大腦中動脈阻塞1.5 h再灌注模型。實(shí)驗(yàn)前對大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。在大鼠予10%水合氯醛(0.3 mL·100 g-1)麻醉下，取仰臥位固定，頸前區(qū)備皮消毒后沿頸正中線切開3～4 cm，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離，找到右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈，在頸總動脈近心端穿線結(jié)扎，遠(yuǎn)心端為松結(jié)。在頸總動脈分叉處暫時(shí)用微動脈夾夾閉。在頸總動脈兩線間，距頸總動脈分叉處5 mm左右處將直徑約0.23 mm的栓線插入頸總動脈后，取下微動脈夾。然后將栓線沿右側(cè)頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，至大腦中動脈，插入(深度為18.5±0.5 mm)有阻力感時(shí)停止，將遠(yuǎn)心端的拴線系緊，縫合切口缺血1.5 h后抽出栓線，并給大鼠腹腔注射1 mL·100 g-1的限制性補(bǔ)液。術(shù)后各組采用Garcia JH評分為8～12分的大鼠即造模成功。(除假手術(shù)組除不插栓線外，余下步驟同模型組)

2.2 分組及給藥 120只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組及兩方合用組，每組20只，正常組和假手術(shù)組不予任何藥物治療正常喂養(yǎng)，模型組予等容量的生理鹽水灌胃，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組分別以小續(xù)命湯、桃紅四物湯1 mL·100 g-1·d-1灌胃，而兩方合用組先予小續(xù)命湯劑量(60 g·kg-1·d-1)治療3 d，后再予桃紅四物湯治療。治療至第7天時(shí)對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分后處死，取腦組織進(jìn)行TTC染色和Nissl染色。

2.3 神經(jīng)功能缺損 評分參照Garcia JH評分標(biāo)準(zhǔn)[4]，從大鼠自主運(yùn)動、前爪伸展功能、體態(tài)運(yùn)動的對稱性、身體雙側(cè)觸覺、網(wǎng)屏抓取實(shí)驗(yàn)、雙側(cè)觸須反應(yīng)6個(gè)方面進(jìn)行神經(jīng)功能評分，記錄并分別作比較。

2.4 2,3,5-氯化三苯基四氮唑 (TTC)染色按照TTC染色試劑盒說明，將腦組織置于-20 ℃冰箱中冰凍25 min后取出，制成的冠狀切片厚度約為2 mm，放入2%的TTC染液避光器皿中，置于37 ℃的恒溫烘箱中25～30 min染色，15 min翻動一次使其均勻接觸到染色液。染色后取出置于4%多聚甲醛中避光保存，固定24 h后將腦組織取出按切片順序排列拍照，并使用Image-Pro-Plus 6.0分析軟件測出腦梗死面積，再根據(jù)腦梗死體積百分率/%=腦梗死區(qū)體積/正常側(cè)大腦半球體積×100%公式計(jì)算梗死體積。

2.5 Nissl染色 使用蒸餾水沖洗固定好的腦組織，換無水乙醇脫水，二甲苯溶液透明腦組織，石蠟包埋后再切片。使用APTES浸泡撈片后置于60 ℃烤箱中60 min使切片緊密黏附，切片按常規(guī)脫蠟至水，放入經(jīng)預(yù)熱至50 ℃的1%氯托洛寧水溶液中，置于56 ℃溫箱中20 min染色，再用蒸餾水沖洗后酒精分化、脫水，鏡下控制，以尼氏小體顯示清晰為度，再使用無水乙醇脫水二甲苯透明2次后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察尼氏體數(shù)量和大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)進(jìn)行拍照分析結(jié)果。染色后的尼氏小體可呈藍(lán)紫色。

3 結(jié)果

3.1 小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響 正常組及假手術(shù)組大鼠均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)(P>0.05)；模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組、兩方合用組大鼠神經(jīng)功能評分顯著提升(P<0.05)，而兩方合用組大鼠神經(jīng)功能評分顯著高于小續(xù)命湯組和桃紅四物湯組(P<0.05)，其中，桃紅四物湯組的神經(jīng)功能評分與小續(xù)命湯組比較組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響

3.2 小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積率的影響 正常組及假手術(shù)組大鼠腦組織切片無蒼白梗死區(qū)；模型組有大范圍白色梗死灶出現(xiàn)，經(jīng)小續(xù)命湯、桃紅四物湯、兩方合用治療后大鼠腦組織切片的蒼白梗死面積均有不同程度的縮小。與模型組比較，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組、兩方合用組大鼠腦組織切片的腦梗死體積率均明顯降低(P<0.05)。兩方合用組的腦梗死體積率顯著低于小續(xù)命湯組和桃紅四物湯組(P<0.05)，桃紅四物湯組腦梗死體積率低于小續(xù)命湯組(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積率的影響

圖1 TTC染色梗死面積大小的變化

3.3 小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠存活神經(jīng)元個(gè)數(shù)的影響 正常組與假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)元個(gè)數(shù)無明顯差異(P>0.05)，模型組大鼠的神經(jīng)元個(gè)數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型組相比，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組及兩方合用組神經(jīng)元存活個(gè)數(shù)顯著增多(P<0.05)，兩方合用組神經(jīng)元存活個(gè)數(shù)明顯多于小續(xù)命湯組和桃紅四物湯組(P<0.05)，桃紅四物湯組神經(jīng)元存活個(gè)數(shù)又多于小續(xù)命湯組(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠存活神經(jīng)元個(gè)數(shù)的影響

4 討論

缺血性腦血管疾病是因組織和器官血液供應(yīng)不足，多機(jī)制、多環(huán)節(jié)相互作用，出現(xiàn)一系列復(fù)雜的結(jié)構(gòu)損害和功能障礙的神經(jīng)性疾病，細(xì)胞的凋亡壞死是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)之一。研究[5]認(rèn)為，及時(shí)恢復(fù)大腦缺血區(qū)域供血和減少神經(jīng)細(xì)胞損害是治療腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。目前，對缺血性再灌注性腦損傷繼發(fā)神經(jīng)細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制并無定論，臨床上治療神經(jīng)細(xì)胞損傷的藥物也極度匱乏，因此，腦缺血再灌注損傷的病理機(jī)制、防治方法和藥物的研究是近年來的熱點(diǎn)所在。部分研究[6-7]發(fā)現(xiàn)小續(xù)命湯與桃紅四物湯的有效成分均可改善腦缺血再灌注損傷的癥狀及神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)。

中醫(yī)無腦血管疾病、腦缺血再灌注這個(gè)病名，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載可以參照中醫(yī)之“中風(fēng)和腦卒中”進(jìn)行辨證論治。小續(xù)命湯出自孫思邈《備急千金要方》，具有祛風(fēng)散寒、益氣活血、通絡(luò)等功效，臨床上多用于急性腦梗死患者的治療減少神經(jīng)功能損傷，不良反應(yīng)較少[8-9]。研究[10-11]表明，該方可改善腦缺血、增加腦組織血流量，及時(shí)恢復(fù)大腦缺血區(qū)域供血減少神經(jīng)功能損傷，促進(jìn)對突觸生長及神經(jīng)細(xì)胞本身的保護(hù)作用，有效恢復(fù)神經(jīng)功能和修復(fù)腦組織而改善腦缺血再灌注損傷。桃紅四物湯出自《醫(yī)壘元戎》，由四物湯加桃仁、紅花組成使之為治療腦血管疾病活血化瘀的經(jīng)典方劑。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)該方能改善腦部血流動力學(xué)、抑制細(xì)胞的凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)血管修復(fù)因子及促進(jìn)腦缺血再灌注損傷大腦神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，減少腦梗死體積。

本實(shí)驗(yàn)使用小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注模型大鼠進(jìn)行干預(yù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過小續(xù)命湯、桃紅四物湯及兩方合用的治療，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組及兩方合用組均能改善神經(jīng)功能缺損障礙，降低腦梗死體積率及增加大鼠大腦皮質(zhì)頂葉區(qū)尼氏體數(shù)量，其中以桃紅四物湯組的療效為優(yōu)，而兩方合用組的療效較單用小續(xù)命湯組和桃紅四物湯組更為顯著。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)早期單用小續(xù)命湯較單用桃紅四物湯治療大鼠的死亡率更低，神經(jīng)功能評分相對桃紅四物湯組更高，推測可能與小續(xù)命湯具有扶正祛風(fēng)的作用有關(guān)，更適合應(yīng)用于急性期。