崔新剛 王穎瑩 王新勝

1.河南省洛陽市婦幼保健院，河南 洛陽 471000；2.河南省洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471000；3.河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽 471000

復(fù)方丹參片系由丹參、三七、冰片組成的中藥復(fù)方制劑，具有活血化瘀，理氣止痛作用，為《中國藥典》2015版收載的成方制劑[1]。主治氣滯血瘀所致的胸痹，癥見胸悶、心前區(qū)刺痛；冠心病心絞痛[2]。目前，我國已有數(shù)家藥廠的復(fù)方丹參片投放市場，但臨床反映不同廠家復(fù)方丹參片的療效存在明顯差異?；瘜W(xué)成分研究顯示不同廠家復(fù)方丹參片中有效成分含量差異顯著[3-4]。為了評價不同廠家復(fù)方丹參片的質(zhì)量差異，陳永等[5]測定三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量，評價復(fù)方丹參片質(zhì)量。馬啟武[6]測定復(fù)方丹參片中丹參酮IIA、丹酚酸B的含量，比較其質(zhì)量差異?，F(xiàn)有報道中提到的評價方法常以其中一味藥評價其質(zhì)量，通常為方中的君藥或臣藥，不能全面反映其質(zhì)量差異。本研究參考《中國藥典》2015年版中對復(fù)方丹參片的檢測方法，在《中國藥典》檢測方法的基礎(chǔ)上對檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，將丹參酮IIA、丹酚酸B及三七總皂苷含量作為質(zhì)量評價指標(biāo)。為了更好的綜合比較、評價不同廠家復(fù)方丹參片的質(zhì)量，本研究以復(fù)方丹參片中丹參酮IIA、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1及人參皂苷Re為指標(biāo)，進(jìn)行聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，旨在為其質(zhì)量控制提供依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀，包括G1315B型二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器(美國安捷倫科技有限公司)；KQ-100ES超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；賽多利斯BSA8201電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；易普易達(dá)Smart-S2型超純水機(jī)(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丹參酮ⅡA對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110766-201816)；丹酚酸B對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111562-201702)；人參皂苷Rg1對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：l10703-201728)；人參皂苷Rb1對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110704-201722)；三七皂苷R1對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110745-201614)；人參皂苷Re對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110754-201823)。樣品分別購于不同廠家共10批次，每個廠家購買2個批次，分別為北京A公司(批號：20190933；20190331，編號S1-2)、廣州的B公司(批號：L18A011；L18A017，編號S3-4)、云南的C公司(批號：201811；201910，編號S5-6)、湖北的D公司(批號：20190910；20190814，編號S7-8)、上海的E公司(批號：201906107；201811027，編號S9-10)。甲醇、乙腈為色譜純(天津天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲酸為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：甲醇-水(73：27)；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：270 nm。

2.1.2 對照品制備 精密稱取丹參IIA對照品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含對照品40 μg的溶液，即得對照品溶液。

2.1.3 供試品制備 取本品10片，糖衣片需先除去糖衣，精密稱定，研細(xì)粉，取約1 g細(xì)粉，置于具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量。將所制得供試品溶液進(jìn)行超聲處理(功率250W，頻率33kHz)15 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，置棕色瓶中，即得供試品溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察[2]

2.1.4.1 重復(fù)性試驗 取復(fù)方丹參片(批號：20190933、L18A011、201811、20190910、2019061 07，即S1、S3、S5、S7、S9)按供試品溶液的制備方法分別平行制備6份供試品溶液，按2.1.1色譜條件檢測丹參酮IIA的平均含量，結(jié)果見表1，表明本方法重復(fù)性良好，精密度較高。

2.1.4.2 穩(wěn)定性試驗 取復(fù)方丹參片(批號：20190933、L18A011、201811、20190910、201906107)供試品溶液，按本試驗色譜條件分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)行檢測，計算丹參酮IIA峰面積RSD，結(jié)果見表1，表明本方法穩(wěn)定性良好。

2.1.4.3 加樣回收率試驗 取已知含量復(fù)方丹參片樣品(批號：20190933、L18A011、201811、20190910、201906107)，分別加入一定量的對照品溶液后，測定含量，計算回收率，結(jié)果見表1，回收率良好。

2.1.5 樣品測定 按2.1.3制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液和對照品溶液各10 μL，按2.1.1色譜條件，分別測定10個樣品中的丹參酮IIA，以外標(biāo)法計算含量。色譜圖見圖1，測定結(jié)果見表1。

圖1 對照品(A)和樣品(B)色譜圖

2.2 丹酚酸B的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：乙腈-甲醇-甲酸-水(10∶30∶1∶59)；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：286 nm。

2.2.2 對照品制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，置于棕色量瓶中，加水制成每1 mL含對照品60 μg的溶液，即得對照品溶液。

2.2.3 供試品制備 取本品10片，糖衣片需先除去糖衣，精密稱定，研細(xì)粉，取0.15 g細(xì)粉，置于50 mL棕色量瓶中，加水適量，將所制得供試品溶液進(jìn)行超聲處理(功率300W，頻率50kHz)30 min，放冷，加水至刻度，搖勻，離心機(jī)離心，取上清液，即得供試品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察 按照2.1.4方法，結(jié)果見表1，表明本方法重復(fù)性良好，精密度較高，穩(wěn)定性良好，回收率良好。

2.2.5 樣品測定 按2.1.4樣品測定方法。色譜圖見圖2，測定結(jié)果見表1。

表1 方法學(xué)考察結(jié)果

圖2 對照品(A)和樣品(B)色譜圖

2.3 三七總皂苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按規(guī)定條件進(jìn)行梯度洗脫，詳見表2；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：203 nm。

表2 不同廠家指標(biāo)成分含量測定結(jié)果(mg/片)

表2 三七總皂苷流動相條件

2.3.2 對照品制備 精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品及人參皂苷Re對照品適量，加70%甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1各0.2 mg，三七皂苷R1及人參皂苷Re各0.05 mg的混合溶液，即得對照品溶液。

2.3.3 供試品制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)粉，取約1 g，精密稱定，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，將所制得供試品溶液進(jìn)行超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。。

2.3.4 方法學(xué)考察 按照2.1.4.方法，結(jié)果見表1，表明本方法重復(fù)性良好，精密度較高，穩(wěn)定性良好，回收率良好。

2.3.5 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定。色譜圖見圖3，測定結(jié)果見表1。

圖3 對照品(A)和樣品(B)色譜圖

2.4 主成分分析 以10批復(fù)方丹參片中的指標(biāo)成分含量測定結(jié)果為變量，運用SPSS Statistics 18.0軟進(jìn)行主成分分析，計算成分特征值、貢獻(xiàn)率及累計貢獻(xiàn)率，前2個主成分累計貢獻(xiàn)率為96.692%，可以反映復(fù)方丹參片質(zhì)量，結(jié)果見表3。將10批復(fù)方丹參片中指標(biāo)成分含量結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P 14.5軟件，得分矩陣圖見圖4。S1～2為一類，S3～6為一類，S7～10為一類。

2.5 聚類分析 以復(fù)方丹參片的指標(biāo)成分含量結(jié)果為變量，運用SPSS Statistics 18.0統(tǒng)計軟件，采用組間連接法，以歐式平方距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖5。由圖可知在組間距為25時，10批樣品分為3類，S1～2為一類，S3～6為一類，S7～10為一類，該結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致。

2.6 正交偏最小二乘判別分析 以含量測定結(jié)果為變量，導(dǎo)入SIMCA-P1 14.5軟件，進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析，模型參數(shù)為R2X為1，R2Y為0.892，Q2為0.312，說明矩陣良好，得分矩陣圖見圖6。分類結(jié)果與主成分分析、聚類分析結(jié)果一致。以VIP值大于1位標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到指標(biāo)成分三七皂苷R1、丹酚酸B和人參皂苷Re為復(fù)方丹參片的差異組分，見表3。

表3 主成分特征值和貢獻(xiàn)率

表4 復(fù)方丹參片中指標(biāo)成分的VIP值

圖6 復(fù)方丹參片正交偏最小二乘判別分析得分圖

3 討論

復(fù)方丹參片為我國的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，是常用臨床藥。表1可知，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片都符合《中國藥典》2015版標(biāo)準(zhǔn)，每片含丹參酮ⅡA不得少于0.20 mg，丹酚酸B不得少于5.0 mg，人參皂苷Rg1、人參皂苷 Rb1、三七皂苷R1及人參皂苷Re的總量不得少于6.0 mg。但主成分分析和聚類分析結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片間存在一定的差異，正交偏最小二乘判別分析結(jié)果表明三七皂苷R1、丹酚酸B和人參皂苷Re是控制復(fù)方丹參片的關(guān)鍵成分。

基于主成分分析和聚類分析結(jié)果，同一廠家不同批次的樣品聚為一類，說明同一廠家化學(xué)組分差異較小，質(zhì)量較穩(wěn)定。由圖4～5可知，不同廠家如兩個廠家編號S3～4與S5～6，廠家S7～8與廠家S9～10復(fù)方丹參片聚為一類，結(jié)果表明這些生產(chǎn)廠家可能在原料來源和生產(chǎn)工藝具有類似之處。本研究獲得的結(jié)果為復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。