李偉 劉濤 李霞 王巧云 白小崗 李哲璽

糖尿病會(huì)導(dǎo)致心血管疾病、腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變和下肢糖尿病性潰瘍等并發(fā)癥[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。根據(jù)世衛(wèi)組織的報(bào)告[2]，糖尿病影響全球4.22億成年人，預(yù)計(jì)到2045年將達(dá)到6.93億[3]，1/4的糖尿病患者會(huì)發(fā)展為糖尿病足(Diabetic foot，DF)。DF是糖尿病患者致死、致殘的主要原因[4]。

傷口愈合過程需要細(xì)胞活化來激活，涉及表皮干細(xì)胞(Epidermal stem cells，ESCs)、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，血小板和巨噬細(xì)胞等[5]。與健康人群相比，由于血糖水平升高，糖尿病患者創(chuàng)傷的愈合過程變慢。研究表明，糖尿病患者的ESCs沒有接收到對(duì)于傷口定位至關(guān)重要的信號(hào)，導(dǎo)致創(chuàng)面血管生成的減緩，使創(chuàng)面愈合困難甚至遷延不愈[6]。

絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum)作為一種中草藥，其藥用價(jià)值主要在于可調(diào)節(jié)心腦血管、調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等[7]。絞股藍(lán)的主要活性成分絞股藍(lán)皂苷XLⅨ(Gypenosides XLⅨ)可促進(jìn)組織的損傷修復(fù)和創(chuàng)面愈合。與其他皂苷類成分一樣，XLⅨ的性質(zhì)不穩(wěn)定，可被腸內(nèi)菌代謝成多種代謝產(chǎn)物，也能在胃液中被降解[8]，其生物利用度低。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(Nanostructured lipid carriers，NLCs)不僅載藥能力高而且生物穩(wěn)定性好，緩釋效果顯著[9]。本文采用高壓均質(zhì)法制備載絞股藍(lán)皂苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(XLⅨ-NLCs)，并評(píng)估XLⅨ-NLCs對(duì)ESCs細(xì)胞活性的影響，及其對(duì)DF創(chuàng)面愈合的修復(fù)、血漿內(nèi)皮素(Endothelin，ET)和降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

100只清潔級(jí)成年SD雄性大鼠(延安大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，7～8周齡，體質(zhì)量230～286 g。ESCs(上海欽誠生物有限公司)；單硬脂酸甘油酯(國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)、Maisine35-1和LabrafilM1944 CS(佳法賽公司，法國)；大豆磷脂購自江蘇海泰納米材料有限公司；ET、CGRP的放免藥盒(北京市福瑞生物工程公司)。

YP11-2型磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；Essentia LC-15C高效液相色譜儀(島津公司，日本)；AX205十萬分之一電子天平(Mettler Toledo公司，瑞士)；微納顆粒激光粒徑測(cè)定儀(濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司)；透射電鏡HD-2700購于日本日立高新技術(shù)有限公司。

1.2 XLⅨ-NLCs的制備

制備XLⅨ-NLCs：將XLⅨ加入到2 mL大豆磷脂中，得到100 μg/mL的XLⅨ，以10 mL去離子水溶解，構(gòu)成水相，在74 ℃的水浴中持續(xù)磁力攪拌。將50 mg的Maisine35-1和20 mg的LabrafilM1944 CS溶解于3 mL體積的三乙胺以獲得油相。將油相滴入到水相中。待體系澄清時(shí)，降低轉(zhuǎn)速，繼續(xù)攪拌至總體積的1/3，冰水浴2 h。最后經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜濾過，得到XLⅨ-NLCs。

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)分析XLⅨ-NLCs材料的純度。用原子力顯微鏡(AFM)和透射電子顯微鏡(TEM)表征XLⅨ-NLCs顆粒的粒徑和形狀。廣角X射線衍射(XRD)對(duì)XLⅨ-NLCs顆粒的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。用動(dòng)態(tài)光學(xué)粒度分析儀測(cè)定XLⅨ-NLCs的粒徑分布。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將ESCs培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，DMEM培養(yǎng)基中含有10%BSA、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素，pH7.2～7.4。將ESCs細(xì)胞分為對(duì)照組、NLCs組、XLⅨ組、XLⅨ-NLCs組。對(duì)照組，為正常培養(yǎng)無處理的ESCs；NLCs組，正常培養(yǎng)的ESCs使用40 μg/mL NLCs處理12 h；XLⅨ組，正常培養(yǎng)的ESCs使用40 μg/mL的XLⅨ處理12 h；XLⅨ-NLCs組，正常培養(yǎng)的ESCs使用40 μg/mL的XLⅨ-NLCs處理12 h。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ESCs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL，接種于96孔板(100 μL/孔)，37 ℃下培養(yǎng)12 h。以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，在24、48和72 h時(shí)檢測(cè)570 nm處的光密度值(OD)。細(xì)胞活性的百分比用作納米脂質(zhì)顆粒對(duì)細(xì)胞活力影響的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.5 DF創(chuàng)傷大鼠模型構(gòu)建

2%的鏈脲佐菌素50 mg/Kg腹腔注射，72 h后尾靜脈取血，測(cè)血糖值，血糖≥16.8 mmol/L提示DF大鼠制備成功。大鼠麻醉后在足背部剪開1 cm半徑的圓形皮膚創(chuàng)口，暴露韌帶，手術(shù)全程保持自然暴露。

1.6 動(dòng)物分組與給藥

將100只SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常組(n=20)、DF組(n=20)、DF+NLCs組(n=20)、DF+XLⅨ組(n=20)、DF+XLⅨ-NLCs組(n=20)。DF組、DF+NLCs組、DF+XLⅨ組、DF+XLⅨ-NLCs組均進(jìn)行DF造模處理，正常組不制備DF模型，僅給予創(chuàng)傷處理。造模第2天給藥，正常組和DF組不進(jìn)行藥物干預(yù)。DF+NLCs組、DF+XLⅨ組、DF+XLⅨ-NLCs組均進(jìn)行灌胃給藥，分別給予100 μL的NLCs、XLⅨ和XLⅨ-NLCs，每日1次，連續(xù)7 d。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

記錄創(chuàng)傷后7 d的創(chuàng)傷面積，分析各組創(chuàng)傷愈合情況。第8 d，處死大鼠，沿窗口取邊緣約1.0 cm×1.0 cm的皮膚組織，浸泡在40.0%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，鏡下觀察。取材前獲取大鼠靜脈血3 mL，置于含10% EDTA 30 mL和400 IU抑肽酶的試管中，混勻，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-30 ℃冰凍保存。采用放射免疫法測(cè)定，并嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 XLⅨ-NLCs的物理性質(zhì)和表征

采用高壓均質(zhì)法制備XLⅨ-NLCs，粒徑參數(shù)通過DLS法測(cè)定。結(jié)果顯示，XLⅨ-NLCs的直徑為(207.92±21.75)nm(圖1A)。包封率為73.61%±4.55%，載藥量為5.23%±0.58%。透射電鏡觀察，XLⅨ-NLCs形狀為近似球體，納米顆粒分布均勻(圖1B)。

A：動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)粒徑大小；B：透射電子顯微鏡觀察NLCs、XLⅨ-NLCs形態(tài)(標(biāo)尺= 100 nm)。A: Dynamic light scattering measurement of particle size; B: Morphological observation of NLCs and XLⅨ-NLCs by TEM (scale=100 nm).圖1 XLⅨ-NLCs的理化性質(zhì)Fig.1 Physicochemical properties of XLⅨ-NLCs

2.2 XLIX-NLCs對(duì)ESCs的細(xì)胞毒性

觀察對(duì)照組(Ctrl)、XLⅨ組、NLCs組、XLⅨ-NLCs組ESCs細(xì)胞的活性(圖2)。與對(duì)照組相比，NLCs組與XLⅨ組中ESCs細(xì)胞活性均無顯著差異(P>0.05)，而XLⅨ-NLCs組中ESCs細(xì)胞活性高于對(duì)照組、XLⅨ組和NLCs組(P<0.05)。

*： 與對(duì)照組比，P<0.05； #： 與XLⅨ組相比，P<0.05；&：與NLCs組相比，P<0.05。*: Compared with control group, P<0.05; #: Compared with XLⅨ group, P<0.05; &: compared with NLCs, P<0.05.圖2 采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞毒性Fig.2 MTT assay was used to detect the cell cytotoxicity in each group

2.3 XLⅨ-NLCs對(duì)DF大鼠創(chuàng)面愈合的影響

如圖3所示，傷后7 d時(shí)，DF組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組、DF+XLⅨ-NLCs各組的創(chuàng)傷面積均顯著大于對(duì)照組(P<0.05)；DF+XLⅨ組、DF+NLCs組、DF+XLⅨ-NLCs組的創(chuàng)傷面積均顯著小于DF組(P<0.05)；DF+XLⅨ-NLCs組的創(chuàng)傷面積均明顯小于DF+XLⅨ組和DF+NLCs組(P<0.05)。

A：各組大鼠足部創(chuàng)傷愈合效果觀察；B：各組大鼠足部創(chuàng)傷面積大小比較($： 與Ctrl組比，P<0.05；*：與DF組比，P<0.05；#： 與DF+XLⅨ組相比，P<0.05；&：與DF+NLCs組相比，P<0.05)；C：各組大鼠足部創(chuàng)傷部位組織HE染色。A: Observation of foot wound healing in each group; B: Comparison of foot trauma area of each group ($: Compared with Ctrl group, P<0.05; *: Compared with DF group, P<0.05; #: compared with DF+XLⅨ group, P<0.05; &: Compared with DF+NLCs group, P<0.05); C: HE staining of the injured parts in each group.圖3 XLIX-NLCs對(duì)DF大鼠創(chuàng)面愈合的影響Fig.3 Effects of XLIX-NLCS on wound healing of DF rats

光鏡觀察結(jié)果顯示，DF組可見較多炎性細(xì)胞，少見成纖維細(xì)胞，罕見新生毛細(xì)血管；正常組的炎性細(xì)胞數(shù)量最少，成纖維細(xì)胞多，可見散在的新生毛細(xì)血管；與DF組相比，DF+NLCs組、DF+XLⅨ組可見少量的炎性細(xì)胞，成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，大量新生毛細(xì)血管。DF+XLⅨ-NLCs組與DF+XLⅨ組、DF+NLCs組相比，炎性細(xì)胞量更少，成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，新生毛細(xì)血管較多。總體而言，DF+XLⅨ-NLCs組毛細(xì)血管增生明顯，成纖維細(xì)胞較多且染色較深，炎性細(xì)胞少見；DF+NLCs組和DF+XLIX組居中；DF組最差，極少見血管增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯(圖3C)。

2.4 XLIX-NLCs對(duì)DF大鼠ET-CGRP平衡的影響

圖4顯示，與Ctrl組比，DF組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組的ET水平均都顯著上調(diào)(P<0.05)，DF+XLⅨ-NLCs組變化不明顯(P>0.05)。與Ctrl組比，DF組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組的CGRP水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，DF+XLⅨ-NLCs組變化不明顯(P>0.05)。DF+XLⅨ-NLCs組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組中的ET水平都顯著低于DF組，而DF+XLⅨ-NLCs組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組中的CGRP水平都顯著高于DF組(P<0.05)。DF+XLⅨ-NLCs組的ET水平顯著低于DF+XLⅨ組和DF+NLCs組，DF+XLⅨ-NLCs組的CGRP水平顯著高于DF+XLⅨ組和DF+NLCs組(P<0.05)。

A：血液中ET水平；B：血液中CGRP水平；$：與Ctrl組比，P<0.05；a：與DF組比，P<0.05；b：與DF+XLⅨ組相比，P<0.05；c：與DF+NLCs組相比，P<0.05。$: Compared with Ctrl group, P<0.05; a: Compared with DF group, P<0.05; b: Compared with DF+XLⅨ group, P<0.05; c: Compared with DF+NLCs group, P<0.05.圖4 各組大鼠血液ET-CGRP平衡的變化Fig.4 Changes of ET-CGRP balance of rat blood in each group

3 討論

糖尿病患者皮膚損傷后極難愈合。研究表明，表皮干細(xì)胞分化和表皮細(xì)胞生長(zhǎng)障礙、糖代謝紊亂、微血管病變、細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)異常等多種因素，均與糖尿病創(chuàng)面難愈有密切關(guān)系。Zhang等[5]的研究顯示，ESCs可主動(dòng)參與創(chuàng)面修復(fù)，并促進(jìn)創(chuàng)面的再上皮化。ESCs在不同病期糖尿病大鼠皮膚中的分布規(guī)律，及其在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中的動(dòng)態(tài)變化，提示糖尿病創(chuàng)面表皮干細(xì)胞數(shù)量顯著減少、活性明顯降低，并存在局部特有的“干細(xì)胞庫干涸”現(xiàn)象[10]。皂甙類藥物具有多種藥理活性，對(duì)創(chuàng)面愈合具有明顯的改善作用[11]。XLⅨ是一種從中草藥絞股藍(lán)中提取出來的皂苷。研究發(fā)現(xiàn)，XLⅨ不僅可改善組織的損傷、調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥平衡，特別是對(duì)神經(jīng)損傷[12]和心肌損傷有明顯的改善作用[13]，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性有抑制作用[14]。已有報(bào)道證實(shí)XLⅨ對(duì)糖尿病具有潛在的改善作用，例如改善糖尿病心肌病[15]和抗糖尿病[16]。然而，仍缺乏關(guān)于XLⅨ對(duì)糖尿病創(chuàng)傷修復(fù)的研究。本研究結(jié)果證實(shí)，XLⅨ修復(fù)DF大鼠創(chuàng)面效果明顯優(yōu)于未使用XLⅨ的對(duì)照組，而該愈合過程可能與促進(jìn)表皮干細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)。

DF的另一個(gè)關(guān)鍵影響因素是機(jī)體的末梢血管病。末梢血管病變可導(dǎo)致下肢感染趨于嚴(yán)重，形成潰瘍并破壞深部組織。血管內(nèi)皮損傷是DF血管病變的最初原因，血液中高水平的ET是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵標(biāo)志之一；另外，CGRP是一種強(qiáng)的內(nèi)源性血管舒張劑[17]。ET和CGRP的平衡是調(diào)節(jié)血管收縮與舒張功能關(guān)鍵，兩者的合成、分泌及效應(yīng)失衡可致血管緊張度改變，直接影響血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，DF大鼠的ET水平明顯升高、CGRP水平下降，符合已有的報(bào)道。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，使用XLⅨ灌胃可明顯抑制血液中ET的水平并提高CGRP的水平，表明XLⅨ可通過改善血管病變并增加DF創(chuàng)傷修復(fù)效率。

納米材料對(duì)創(chuàng)傷愈合、抑制創(chuàng)口感染、組織再生等具有重要作用。固體脂質(zhì)納米顆粒(SLNs)具有受控輸送系統(tǒng)的多種優(yōu)勢(shì)，代表了親水和親脂活性化合物的良好選擇；沒有生物毒性，可改善藥物的生物利用度和靶向性；可通過生物屏障促進(jìn)擴(kuò)散；易制備獲取，其生產(chǎn)過程可以是無溶劑的。多項(xiàng)研究提出，這種載體可改善傷口愈合。Arana等[19]將金盞菊提取物摻入SLNs中，以改善游離提取物的傷口愈合活性。NLCs是繼固體脂質(zhì)納米粒(SLNs)之后的二代脂質(zhì)體系，解決了SLNs存在的各種缺點(diǎn)。NLCs由液體脂質(zhì)和固體脂質(zhì)的混合物組成，具有更高的負(fù)載能力和更大的穩(wěn)定性[20]。穿心蓮內(nèi)酯是一種天然的二萜內(nèi)酯，具有抗炎和抗氧化作用，可改善傷口的愈合活性。然而，穿心蓮內(nèi)酯的問題與其水溶性低有關(guān)。Sanad等[21]將穿心蓮內(nèi)酯配制成脂質(zhì)納米載體，然后將其包含在殼聚糖-透明質(zhì)酸復(fù)合海綿支架中，效果良好。本研究中，由于XLⅨ同樣是一種低水溶性和低脂溶性藥物，因此想要發(fā)揮其更高的效價(jià)，將XLⅨ負(fù)載于NLCs中，可能會(huì)在藥物利用率上進(jìn)一步提高。我們通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比也證實(shí)了這一假設(shè)。我們構(gòu)建了載絞股藍(lán)皂苷的納米脂質(zhì)載體XLⅨ-NLCs并鑒定了其理化性質(zhì)，觀察到XLⅨ-NLCs對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)的作用優(yōu)于單獨(dú)使用NLCs或XLⅨ，并且提高了 CGRP的水平并降低了ET水平。

綜上所述，本研究探討了NLCs-XLⅨ對(duì)DF創(chuàng)面修復(fù)的改善作用及其潛在的作用機(jī)理。盡管NLCs-XLⅨ對(duì)DF創(chuàng)面愈合活性的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但本研究結(jié)果表明NLCs-XLⅨ具有有效的創(chuàng)面愈合活性。因此，NLCs-XLⅨ是一種可用于糖尿病足皮膚創(chuàng)面愈合的新的潛在藥物。