陳 彬, 姜旭萌, 宋 杰, 梁俊峰

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所,廣東 廣州 510520；2.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院,江蘇 南京 210037；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

紅菇屬(Russula)隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)傘菌綱(Agaricomycetes)紅菇目(Russulales)紅菇科(Russulaceae)，目前已知該屬真菌800余種，但據(jù)估計(jì)實(shí)際超過(guò)2 000種[1-4].李國(guó)杰[5]報(bào)道了我國(guó)紅菇屬的193個(gè)記錄，可通過(guò)標(biāo)本確認(rèn)分類單元的共計(jì)158個(gè)(包括152種1亞種5變種).近年來(lái)，隨著對(duì)紅菇屬真菌資源的進(jìn)一步調(diào)查，我國(guó)又發(fā)現(xiàn)并描述了諸多新種[6-14].紅菇屬真菌廣泛分布于世界各大洲，該屬真菌可與多種植物共生形成外生菌根，在維持森林生態(tài)系統(tǒng)的平衡方面起著重要作用[15].紅菇屬真菌中有很多重要的食藥用菌，據(jù)記載78種可食，如灰肉紅菇(大紅菌、正紅菇)(R.griseocarnosaX.H. Wang et al.)、變綠紅菇(青頭菌)[R.virescens(Schaeff.) Fr.]等[16-18]；還有一些類群具有毒素，誤食可能引起中毒甚至死亡，如亞稀褶紅菇(R.subnigricansHongo)、日本紅菇(R.japonicaHongo)等[19-21].

作者在調(diào)查我國(guó)紅菇屬真菌資源的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了分布于我國(guó)西南的紅菇屬2個(gè)中國(guó)新記錄種——近喜馬拉雅山紅菇和擬克姆霍孜紅菇，在此對(duì)這2個(gè)物種進(jìn)行報(bào)道，為進(jìn)一步了解我國(guó)紅菇屬真菌的物種多樣性提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本材料

近喜馬拉雅山紅菇的4份標(biāo)本于2014年采集于西藏，擬克姆霍孜紅菇的1份標(biāo)本于2014年采集于四川.標(biāo)本經(jīng)50 ℃干燥后保存于中國(guó)林業(yè)科學(xué)院熱帶林業(yè)研究所標(biāo)本館.

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)鑒定 外部形態(tài)特征描述依據(jù)野外采集記錄和子實(shí)體照片.從干燥標(biāo)本各組織取樣，置于5%(體積分?jǐn)?shù))KOH溶液中復(fù)水，再用1%剛果紅試劑染色，在ZEISS Imager M2顯微鏡的明視野或相差視野下觀察顯微特征，并記錄和繪圖；通過(guò)JSM-6510 LV掃描電鏡對(duì)擔(dān)孢子進(jìn)行拍照.在梅氏試劑中對(duì)擔(dān)孢子進(jìn)行測(cè)量并觀察是否有淀粉質(zhì)反應(yīng)[22]；用甲酚藍(lán)測(cè)定表皮異染色性或同染色性[23]；用硫酸香草醛檢測(cè)囊狀體內(nèi)含物顏色的變化[24].

顯微特征的統(tǒng)計(jì)基于每份標(biāo)本一個(gè)子實(shí)體的20次測(cè)量.擔(dān)孢子長(zhǎng)度或?qū)挾纫?a)b～c(d)表示，95%的測(cè)量數(shù)值落在b～c之間，a、d分別為測(cè)量數(shù)據(jù)中的最小值和最大值；長(zhǎng)寬比用Q表示，avQ表示長(zhǎng)寬比的算術(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；[n/m/p]表示測(cè)量p份標(biāo)本的m個(gè)子實(shí)體上的n個(gè)擔(dān)孢子.

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 總DNA提取采用改良的CTAB法[25].使用引物ITS1和ITS4[26]對(duì)ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序.PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司用ABI3730 DNA測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序，將所得序列用ContigExpress軟件拼接，以獲得高質(zhì)量的完整序列.所得序列在GenBank中經(jīng)Blast檢索，獲取相似度較高的同源序列,選擇近緣種(表1)的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.使用MAFFT 7.0 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)比對(duì)所有序列；為了獲取更為合理的比對(duì)結(jié)果，通過(guò)BioEdit[27]進(jìn)行人工調(diào)整,將比對(duì)后的數(shù)據(jù)矩陣上傳到TreeBase(S26964).分別通過(guò)the Cipres Science Gateway(https://www.phylo.org/portal2/)中的RAxML HPC2 on XSEDE(8.2.12)和MrBayes on XSEDE(3.2.6)采用最大似然法(maximum likelihood, ML)和貝葉斯推斷法(Bayesian analysis, BA)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).ML分析在GTRGAMMA模型下進(jìn)行1 000次重復(fù)；BA分析以四條馬爾可夫鏈在GTR模型下進(jìn)行5 000萬(wàn)次重復(fù)，去除前25%的樹(shù)，得到后驗(yàn)概率.

表1 系統(tǒng)發(fā)育分析中使用的近緣種ITS序列信息1)Table 1 ITS sequences of related species used in phylogenetic analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 2個(gè)種的系統(tǒng)發(fā)育分析

ML和BA方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致.圖1為采用ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，靴帶支持率(≥70%)和BA法推斷的后驗(yàn)概率(≥0.95)被標(biāo)示于分支上.由圖1可知，采自我國(guó)西藏的4份標(biāo)本的ITS序列與R.indohimalayana的序列聚在一起，獲得81%靴帶支持率和1的后驗(yàn)概率；四川的1份標(biāo)本的ITS序列與R.pseudokrombholzii的序列聚在一起，獲得100%靴帶支持率和1的后驗(yàn)概率.這表明采自我國(guó)的這5份標(biāo)本分別與印度的2個(gè)種(模式標(biāo)本)相同.

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree based on ITS sequences

2.2 2個(gè)種的形態(tài)特征

2.2.1 近喜馬拉雅山紅菇(RussulaindohimalayanaK. Das, I. Bera, A. Ghosh & Buyck) 子實(shí)體(圖2A)小型至中型.菌蓋直徑30～60 mm，初為半球形，后漸平展且中部略下凹；菌蓋邊緣稍內(nèi)卷，邊緣到中央1/3處有條紋；菌蓋表面黏，蓋表皮可剝離至菌蓋半徑的2/3處；菌蓋中央為黃綠色，邊緣色淺，部分標(biāo)本略帶淡紫色.菌褶直生或略彎生，中等稀疏，白色至乳白色，無(wú)小菌褶，無(wú)分叉.菌柄(36～45) mm×(6～10) mm，近棒狀或棒狀，中生，表面有細(xì)微的縱紋，白色，髓狀中空.菌肉白色，3 mm厚；味微苦，氣味不明顯.孢子印白色.

擔(dān)孢子(圖2B～2D)[80/4/4][(6.6)6.8～8.4(9.1)] μm×(5.7～7.0) μm,[Q=(1.02)1.04～1.26(1.42), avQ=1.17±0.09]，多寬橢圓形，少數(shù)近球形或球形；表面紋飾淀粉質(zhì)，疣突高0.5～0.8 μm，鈍圓的疣突和脊?fàn)罴y飾間連線形成近完整或完整的網(wǎng)紋，臍上區(qū)點(diǎn)斑狀淀粉質(zhì).擔(dān)子(圖3A)(41.0～48.3) μm×(13.8～15.9) μm，棒狀或近棒狀，大多數(shù)4個(gè)擔(dān)子梗.側(cè)生囊狀體(圖3C)(59.3～83.9) μm×(12.6～15.7) μm，紡錘狀或近棒狀，部分一側(cè)出現(xiàn)膨大，頂部多呈乳突狀或鈍圓，內(nèi)含物纖維狀或結(jié)晶狀，在硫酸香草醛中變?yōu)楹诤稚?褶緣囊狀體(圖3D)[(48.0)50.6～72.2(80.5)] μm×[(8.8)9.8～12.7] μm，紡錘狀或棒狀，少數(shù)一側(cè)出現(xiàn)膨大，頂端鈍圓，少數(shù)呈乳突狀，內(nèi)含物纖維狀，在硫酸香草醛中變?yōu)楹诤稚?菌蓋表皮厚約170 μm；上表皮(圖3E)由透明的柵欄狀菌絲和囊狀體組成，末端細(xì)胞[25.5～50.7(70.8)] μm×(2.6～3.5) μm，基本不分叉，通常彎曲，圓柱狀或棒狀，頂端鈍圓或少數(shù)變窄；蓋表囊狀體(圖 3B)(38～81) μm×(5.5～8.1) μm，棒狀或近紡錘狀，內(nèi)含物纖維狀或結(jié)晶狀，在硫酸香草醛中變?yōu)辄S褐色；菌蓋下表皮由相互交織的平伏狀菌絲組成，薄壁，有隔，寬2～5 μm.

A.近喜馬拉雅山紅菇子實(shí)體；B～D.近喜馬拉雅山紅菇擔(dān)孢子；E～F.擬克姆霍孜紅菇子實(shí)體；G～H.擬克姆霍孜紅菇擔(dān)孢子.比例尺：A、E、F為10 mm; B為5 μm; C為10 μm; D、H為1 μm; G為2 μm.圖2 近喜馬拉雅山紅菇和擬克姆霍孜紅菇形態(tài)Fig.2 Morphology of R.indohimalayana and R.pseudokrombholzii

生境：夏季單生或散生于冷杉林下.

分布：印度，中國(guó)(西藏).

A.擔(dān)子；B.蓋表囊狀體；C.側(cè)生囊狀體；D.褶緣囊狀體；E.菌蓋上表皮.比例尺=10 mm.圖3 近喜馬拉雅山紅菇微觀形態(tài)特征Fig.3 Microscopic morphological features of R.indohimalayana

研究標(biāo)本：采自西藏林芝地區(qū)墨脫縣墨脫公路冷杉林，北緯29°35′2.47″，東經(jīng) 95°28′7.79″，海拔1 511 m；2014年7月，王苗T24842(RITF2983)，王苗T24855(RITF2984)，王苗T24856(RITF2985)，王苗T24862(RITF2986).

討論：近喜馬拉雅山紅菇主要形態(tài)特征為菌蓋黃綠色，部分略帶淡紫色，不同標(biāo)本的菌蓋顏色有所不同，菌褶直生或略彎生，無(wú)小菌褶，擔(dān)孢子多寬橢圓形，紋飾間連線形成近完整或完整的網(wǎng)紋.采自我國(guó)的4份標(biāo)本菌蓋顏色較模式標(biāo)本略淺，其他的特征無(wú)明顯區(qū)別.綜合形態(tài)特征及分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將采自我國(guó)的4份標(biāo)本(RITF2983、RITF2984、RITF2985、RITF2986)鑒定為近喜馬拉雅山紅菇(R.indohimalayana)[28].該種與幾個(gè)菌蓋顏色多變的種[平滑紅菇(R.aquosaLeclair)、灰柄紅菇(R.griseascens(Bon & Gaugué) Marti)、多色紅菇(R.bicolorBurl.)和歐泰紅菇(R.raoultiiQuél.)]聚為一支，獲得95%靴帶支持率和1的后驗(yàn)概率，為這些物種的近緣種.

2.2.2 擬克姆霍孜紅菇(RussulapseudokrombholziiK. Das, Hembrom, A. Ghosh & Buyck) 子實(shí)體(圖2E、2F)中型.菌蓋直徑50～70 mm，初為半球形或扁半球形，后漸平展且邊緣略上舉，中央下凹；菌蓋邊緣稍內(nèi)卷，輕微開(kāi)裂，邊緣到中央1/3處有明顯條紋；菌蓋表面黏，蓋表皮可剝離至菌蓋半徑的1/2處；菌蓋中央紅色到葡紅色或紫紅色，邊緣色淺.菌褶彎生或略離生，中等稀疏，白色至乳白色，有小菌褶.菌柄(60～80) mm×(13～15) mm，近棒狀或圓柱狀，中生，表面有細(xì)長(zhǎng)的縱紋，白色至灰白色，髓狀中實(shí)；菌肉灰白色，5 mm厚，味微苦，氣味不明顯.孢子印白色.

擔(dān)孢子(圖2G、2H)[20/1/1][(7.2)7.5～9.6(9.9)] μm×[(6.2)6.3～7.8] μm,[Q=(1.02)1.05～1.31(1.34), avQ=1.20±0.08]，多寬橢圓形或近球形；表面紋飾淀粉質(zhì)，疣突高 0.6～1.2 μm，相鄰紋飾間呈短線或短脊?fàn)钸B接，形成完整網(wǎng)紋或近完整網(wǎng)紋，臍上區(qū)點(diǎn)斑狀淀粉質(zhì).擔(dān)子(圖4A)(33.8～45.8) μm×(7.9～13.4) μm，棒狀或近棒狀，大多數(shù)有4個(gè)擔(dān)子梗.側(cè)生囊狀體(圖4C)[49.9～71.5(82.7)] μm×[7.1～9.5(11.3)] μm，棒狀、近圓柱狀或近紡錘狀，部分具乳突或長(zhǎng)尖，少數(shù)頂端鈍圓，內(nèi)含物纖維狀或結(jié)晶狀，在硫酸香草醛中變?yōu)楹诤稚?褶緣囊狀體(圖4D)(44.0～67.7) μm×(6.6～10.2) μm，棒狀或近圓柱狀，頂端乳突狀或近紡錘狀，內(nèi)含物纖維狀或結(jié)晶狀，在硫酸香草醛中變?yōu)楹诤稚?菌蓋上表皮由透明的匍匐向上狀的菌絲和囊狀體組成；末端細(xì)胞(16.5～44.6) μm×(2.2～4.8) μm，基本不分叉，部分彎曲，近圓柱狀，頂端鈍圓,少數(shù)變窄；蓋表囊狀體(圖4B)[(45.2)47.9～82.0(84.7)] μm×[(5.4)6.9～8.6] μm，棒狀或近圓柱狀，大多數(shù)頂端鈍圓，少數(shù)有紡錘狀附屬物，內(nèi)含物纖維狀，在硫酸香草醛中變?yōu)辄S褐色；菌蓋下表皮由相互交織的膠質(zhì)平伏狀菌絲組成，薄壁，有隔，寬2～6 μm.

A.擔(dān)子；B.蓋表囊狀體；C.側(cè)生囊狀體；D.褶緣囊狀體；E.菌蓋上表皮.比例尺=10 mm.圖4 擬克姆霍孜紅菇微觀形態(tài)特征Fig.4 Microscopic morphological features of R.pseudokrombholzii

生境：生于冷杉和鐵杉為主的混交林下.

分布：印度，中國(guó)(四川).

研究標(biāo)本：采自四川省美姑縣大風(fēng)頂國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)洪溪保護(hù)站，北緯 28°40′33.93″，東經(jīng)103°15′24.35″，海拔3 239 m；2016年7月12日，趙寬DFD85 (RITF3426).

討論：擬克姆霍孜紅菇的主要特征為菌蓋紅色至紫紅色，菌蓋邊緣有明顯的條紋，菌褶彎生或略離生，菌柄白色至灰白色，菌肉灰白色，擔(dān)孢子表面疣突0.6～1.2 μm，疣突間短線連接，形成完整或近完整的網(wǎng)紋.印度模式標(biāo)本的菌蓋顏色較我國(guó)的標(biāo)本稍深，子實(shí)體略大(50～105 mm)，褶緣囊狀體稍小[(35～40) μm×(6.5～8.5) μm]，其他特征基本無(wú)明顯區(qū)別.結(jié)合形態(tài)特征與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將我國(guó)的標(biāo)本(RITF3426)鑒定為擬克姆霍孜紅菇(R.pseudokrombholzii)[28].擬克姆霍孜紅菇與北美的葡萄紫紅菇(R.vinaceaBurl.)以及歐洲的克姆霍孜紅菇(R.krombholziiShaffer)為近緣物種，獲得較高靴帶支持率，并且這些種的菌柄顏色都為灰白色，但擬克姆霍孜紅菇與葡萄紫紅菇和克姆霍孜紅菇的序列相似度不高，分別為93.65%和92.56%.

3 小結(jié)

本研究通過(guò)形態(tài)觀察和系統(tǒng)發(fā)育分析確認(rèn)了采自我國(guó)西南的紅菇屬2個(gè)中國(guó)新記錄種.這2個(gè)種的形態(tài)特征與印度的模式標(biāo)本高度相似：與近喜馬拉雅山紅菇模式標(biāo)本相比，采自我國(guó)西藏的標(biāo)本菌蓋顏色略淺，其他的特征無(wú)明顯區(qū)別；與擬克姆霍孜紅菇模式標(biāo)本相比，采自我國(guó)四川的標(biāo)本菌蓋顏色稍淺，子實(shí)體略小，褶緣囊狀體稍大.2個(gè)中國(guó)新記錄種的ITS序列與模式標(biāo)本序列的相似度都高于99%，并且它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育樹(shù)上分別聚在一起，且獲得較高支持率.因此,將我國(guó)的2個(gè)種分別鑒定為近喜馬拉雅山紅菇和擬克姆霍孜紅菇.