屈貴蜀, 何 晴, 嚴(yán)夢涵, 陸芍華, 黃瑞玲, 彭瑤順, 莊許諾, 許麗惠, 王全溪

[福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建 福州 350002]

番鴨呼腸孤病毒(muscovy duck reovirus, MDRV)是一種具有較高致病性的雙鏈RNA病毒[1]，其引起的番鴨呼腸孤病毒病于1950年首次報(bào)道于南非，上世紀(jì)90年代，我國福建、廣東等地也發(fā)現(xiàn)了此病[2-5].該病主要感染雛番鴨，番鴨感染之后表現(xiàn)出較高的發(fā)病率和死亡率[6].在番鴨的養(yǎng)殖中，該病已經(jīng)是影響其養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一.值得注意的是，MDRV感染引發(fā)的高致死率與其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[7].研究表明，MDRV中編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白p10.8能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]，且p10.8蛋白能夠通過PERK/eIF2α通路誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而介導(dǎo)p10.8蛋白的細(xì)胞周期阻滯和凋亡[9]，p10.8蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡還需要Cdc20及分子伴侶CCT2和CCT5的參與[10].可見，p10.8蛋白是引起MDRV致病的關(guān)鍵蛋白.

單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)技術(shù)，因其特異性強(qiáng)、親和力高等多種優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床的檢測與治療[11].目前，劉思伽等[12]研制了 MDRV的弱毒疫苗；朱小麗等[13]制備了MDRV的mAb，但未確定是針對何種病毒蛋白；張?jiān)频萚14]制備了抗MDRV σB蛋白的mAb；朱二鵬等[15]制備了MDRV σNS蛋白的多克隆抗體；呂小婷等[4]制備了MDRV σA蛋白的多克隆抗體；莊育彬[16]制備了MDRV σC蛋白的多克隆抗體.本課題組前期研究表明，p10.8蛋白可以通過非經(jīng)典途徑進(jìn)入細(xì)胞核，但其不具有核定位信號[17].本試驗(yàn)力求通過p10.8蛋白的mAb去捕獲與p10.8蛋白相互作用的蛋白，從而深入了解p10.8蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的相關(guān)機(jī)制.目前，MDRV p10.8蛋白mAb的研究尚未見報(bào)道,且MDRV p10.8蛋白是其致病的關(guān)鍵蛋白，因此開展MDRV p10.8蛋白mAb的研究對于深入探究MDRV的致病機(jī)制具有十分重要的意義.

1 材料與方法

1.1 材料

高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP107)購自北京天根生化科技有限公司；6～8周齡小鼠購自福建省福州市吳氏動物貿(mào)易有限公司；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、ProteinIsoTMNi-NTA Resin蛋白純化柱(DP101-01)、間接ELISA法所用試劑均購自北京索萊寶科技有限公司；SP2/0細(xì)胞由福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院提供；DF1細(xì)胞、p10.8原核表達(dá)蛋白和真核表達(dá)蛋白均來自于本實(shí)驗(yàn)室；其余常規(guī)試劑均購自國藥試劑公司.

1.2 免疫抗原的制備

參考蔡一龍[18]MDRV p10.8蛋白原核表達(dá)及蛋白純化的方法.將本實(shí)驗(yàn)室保存的p10.8蛋白原核重組菌復(fù)蘇，提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，在最適溫度為37 ℃，IPTG最適濃度為1.0 mmol·L-1的條件下誘導(dǎo)24 h，使目的蛋白大量表達(dá)，收集菌液離心，變性，采用SDS-PAGE電泳檢測p10.8蛋白是否表達(dá).對誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液進(jìn)行離心，用PBS洗兩次，加蛋白平衡液進(jìn)行超聲破碎，最后用Ni-NTA親和層析法進(jìn)行重組蛋白純化，用BCA蛋白濃度檢測法測定蛋白濃度.

1.3 小鼠的免疫

取飼養(yǎng)達(dá)7周齡的健康BALB/c小鼠，用純化的重組p10.8蛋白作為抗原，按照抗原與弗氏佐劑的體積比為1∶1進(jìn)行混合，皮下多點(diǎn)免疫小鼠4次(每隔兩周1次)，抗原免疫劑量為50 μg·只-1·次-1.第1次免疫用1 mL抗原與弗氏完全佐劑的混合液(1∶1)，第2、3次用抗原與弗氏不完全佐劑的混合液(1∶1)，共1 mL.前3次均采用背頸皮下注射，第3次免疫后尾靜脈采血，分離血清，用Western blotting法檢測血清抗體效價(jià).達(dá)到合格效價(jià)后，腹腔注射純化后的抗原(50 μg·只-1)以加強(qiáng)免疫.3 d后采用拉頸的方法將小鼠處死，無菌取出脾臟，用于后續(xù)的細(xì)胞融合試驗(yàn).

1.4 細(xì)胞融合與陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

細(xì)胞融合的前一天，將未免疫的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞鋪在10塊96孔板上作為飼養(yǎng)細(xì)胞.融合當(dāng)天，在無菌條件下取小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞，將脾細(xì)胞用5 mL離心管收集起來，并計(jì)數(shù).將處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0從培養(yǎng)箱取出，離心，計(jì)數(shù)，按照脾細(xì)胞∶SP2/0細(xì)胞以10∶1的數(shù)量比進(jìn)行混合.將PEG誘導(dǎo)劑和DMEM培養(yǎng)基分別用水浴鍋(37 ℃)預(yù)熱，取1 mL PEG誘導(dǎo)劑加入到脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的混合液中，由慢到快，60 s內(nèi)加完.在加入的同時需要攪拌或者搖晃，加完之后再搖1.5 min.在5 min內(nèi)加入10 mL DMEM培養(yǎng)液，然后再加40 mL DMEM培養(yǎng)液，離心，去上清.加入10 mL HAT培養(yǎng)液，按每孔100 μL的量分裝于24孔板中并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).融合10～15 d后，用間接ELISA法檢測細(xì)胞上清效價(jià)，挑選D450 nm高的、細(xì)胞生長旺盛且形態(tài)好的、沒有交叉反應(yīng)的陽性孔，轉(zhuǎn)移到24孔板中.第2天觀察細(xì)胞生長情況，選取細(xì)胞生長狀況好的進(jìn)行計(jì)數(shù).采用有限稀釋法，經(jīng)3次連續(xù)克隆化，直至板中各孔陽性率達(dá)100%，進(jìn)行克隆化的過程中各階段細(xì)胞需要擴(kuò)大培養(yǎng)并收集上清.

1.5 p10.8 mAb特異性鑒定

1.5.1 mAb的Western blotting鑒定 以p10.8 mAb陽性細(xì)胞株培養(yǎng)的上清為一抗，分別與原核表達(dá)、真核表達(dá)的p10.8蛋白進(jìn)行Western blotting反應(yīng)；另取MDRV、禽腺病毒(FAdV)和鴨坦步蘇病毒(DTMUV)全病毒與mAb細(xì)胞培養(yǎng)的上清進(jìn)行反應(yīng).試驗(yàn)均同時設(shè)置陰性對照檢測其生物學(xué)活性.

1.5.2 mAb效價(jià)及亞類的測定 取陽性克隆株細(xì)胞培養(yǎng)上清，用間接ELISA法檢測抗體效價(jià)；按照齊一生物科技(上海)有限公司的單克隆抗體亞類檢測試劑盒說明書的方法檢測抗體亞類.

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-32a-p10.8原核重組蛋白的表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET-32a-p10.8轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞24 h，分別以p10.8基因的上下游引物、T7的上下游引物、p10.8基因的上游引物和T7的下游引物、T7的上游引物和p10.8基因的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，在預(yù)期的相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶(圖1A).SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，p10.8蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)，其特異性條帶位于預(yù)期大小的28.8 ku處(圖1B)，純化效果好，雜蛋白少(圖1C).

A:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21的PCR鑒定(M：2 000 bp DNA Maker;1：p10.8基因的上下游引物;2：T7的上下游引物;3：p10.8基因的上游引物、T7的下游引物;4：T7的上游引物、p10.8基因的下游引物)；B:重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)(M：180 ku蛋白Maker;1：上清;2：沉淀;3：pET-32a空載體表達(dá)組)； C:重組菌的純化(M：180 ku蛋白Maker;1：pET-32a空載體表達(dá)組;2：抗原的純化).圖1 p10.8蛋白原核表達(dá)及純化的檢測結(jié)果Fig.1 Prokaryotic expression and purification of p10.8 protein

2.2 小鼠陽性血清效價(jià)檢測結(jié)果

Western blotting檢測結(jié)果表明，3免后小鼠血清效價(jià)達(dá)1∶32 000(圖2).對小鼠陽性血清進(jìn)行梯度稀釋至1∶256 000，采用間接ELISA法進(jìn)一步檢測血清的酶標(biāo)值(D450 nm)以判定其效價(jià).結(jié)果(表1)顯示，效價(jià)在1∶256 000時，免疫組血清的酶標(biāo)值仍達(dá)0.811 5.

1：PBS空白對照組，2：p10.8原核表達(dá)蛋白組.圖2 血清效價(jià)達(dá)1∶32 000的Western blotting鑒定結(jié)果Fig.2 Western blotting of serum titered at 1∶32 000

表1 陽性血清效價(jià)的ELISA檢測結(jié)果1)Table 1 ELISA test of positive serum

2.3 雜交瘤細(xì)胞篩選結(jié)果與融合細(xì)胞上清效價(jià)檢測結(jié)果

對融合細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測，以待檢孔值∶陰性孔值≥2判定為陽性，挑選比值高的陽性孔進(jìn)行3次克隆化.第1次克隆化檢測到12孔的陽性，結(jié)果如表2所示；第2次克隆化檢測到6孔的陽性，結(jié)果如表3所示；第3次克隆化檢測到2孔的陽性，結(jié)果如表4所示.3次克隆化檢測結(jié)果表明，總共篩選到2孔陽性，分別是3-3B和3-7B.

表3 第2次克隆化檢測的陽性結(jié)果Table 3 Positive selection after 2nd cloning

表4 第3次克隆化檢測的陽性結(jié)果Table 4 Positive selection after 3rd cloning

2.4 mAb與p10.8蛋白的特異性鑒定結(jié)果

將第3次克隆化檢測為陽性孔的3-3B和3-7B上清做1∶2 000稀釋，然后均與原核表達(dá)和真核表達(dá)的p10.8蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，同時設(shè)置His和Flag標(biāo)簽蛋白作為對照.結(jié)果顯示，只有3-7B孔的上清能同p10.8蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，將此雜交瘤細(xì)胞株命名為H3-7B株.圖3顯示，H3-7B株mAb能與p10.8原核表達(dá)、真核表達(dá)蛋白發(fā)生反應(yīng).其中，原核表達(dá)p10.8蛋白與mAb發(fā)生反應(yīng)后，其特異性條帶位于28.8 ku處，與預(yù)期結(jié)果相符(圖3A)；與真核表達(dá)蛋白發(fā)生反應(yīng)后，特異性條帶位于預(yù)期的12.8 ku處(圖3B).表明該H3-7B株mAb是p10.8的mAb.

A:細(xì)胞上清與原核表達(dá)蛋白的Western blotting鑒定(1：PBS空白對照組;2：p10.8原核表達(dá)蛋白組)；B:細(xì)胞上清與真核表達(dá)蛋白的Western blotting鑒定(1：空細(xì)胞對照組;2：p10.8真核表達(dá)蛋白組).圖3 mAb與p10.8蛋白的特異性鑒定結(jié)果Fig.3 Specificity identification of mAb and p10.8 protein

2.5 mAb與MDRV、禽腺病毒、鴨坦步蘇病毒全病毒的反應(yīng)結(jié)果

圖4顯示，雜交瘤細(xì)胞H3-7B株上清能與MDRV全病毒發(fā)生反應(yīng)，而不能與禽腺病毒、鴨坦步蘇病毒全病毒發(fā)生反應(yīng)，表明該mAb對MDRV病毒具有良好的特異性.

圖4 3種病毒與雜交瘤細(xì)胞上清的反應(yīng)性鑒定結(jié)果Fig.4 Reactivity identification of 3 viruses and hybridoma supernatants

2.6 mAb效價(jià)及亞類鑒定結(jié)果

對mAb的亞類進(jìn)行分析，測定酶標(biāo)值(D450 nm).結(jié)果(表5)表明，H3-7B株mAb亞型為IgG2a類.

表5 mAb亞類鑒定結(jié)果1)Table 5 Identification of mAb subclass

3 討論

MDRV感染后侵襲的器官主要是肝臟和脾臟，以靶器官出現(xiàn)灰黃、灰白色壞死點(diǎn)為主要臨床特征[19].MDRV有多個開放閱讀框(ORF)，編碼多種蛋白，共同參與病毒的復(fù)制和感染，其中，p10.8蛋白是導(dǎo)致該病的重要蛋白之一.p10.8蛋白也是一種可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的非結(jié)構(gòu)蛋白，由MDRV S4基因片段的ORF1編碼[20-21].研究表明，p10.8蛋白能夠通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和周期停滯[22]，然而目前仍然多采用真核表達(dá)載體上的標(biāo)簽蛋白抗體來進(jìn)行研究.因此，制備抗MDRV p10.8的抗體對于MDRV分子致病機(jī)制的研究具有十分重要的意義.

本試驗(yàn)采用常規(guī)免疫法對小鼠進(jìn)行3次免疫，第4次免疫后取陽性血清效價(jià)高的脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行融合，并用間接ELISA法檢測細(xì)胞上清的效價(jià)，連續(xù)亞克隆，獲得高效價(jià)的mAb H3-7B株，該抗體特異性強(qiáng).陳桂華等[23]在制備豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)Cap蛋白的mAb時，將抗PCV3 Cap蛋白mAb和抗His標(biāo)簽抗體分別作為一抗進(jìn)行Western blotting鑒定，并在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶.唐澤群等[24]采用chTLR3重組真核質(zhì)粒為免疫原，制備了抗chTLR3的mAb，并用原核蛋白等進(jìn)行生物學(xué)活性特異性鑒定.賈曉雪等[25]在制備和鑒定抗牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)gD蛋白mAb時，曾用IBRV全病毒和重組蛋白對抗體特異性進(jìn)行鑒定.本試驗(yàn)則采用重組原核表達(dá)蛋白作為免疫原制備mAb，用Western blotting法對重組原核蛋白、重組真核蛋白與兩者相應(yīng)的標(biāo)簽蛋白His、Flag進(jìn)行特異性鑒定，并對MDRV全病毒均進(jìn)行了特異性鑒定，mAb均發(fā)生了良好的特異性反應(yīng)，也證明了本試驗(yàn)所制備的mAb具有良好的生物學(xué)活性，且用重組真核蛋白和全病毒抗原檢測可以更好地排除His標(biāo)簽所帶來的干擾.可見，本試驗(yàn)制備的mAb具有良好的特異性.