趙 露，董恬雅，張社歡，劉桂霞

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

長梗韭[Allium neriniflorum（Herb.）G.Don]，蔥屬多年生草本植物，生長于黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西、山東、內(nèi)蒙古、北京等地的山坡、濕地、草地或海邊沙地[1]；長梗韭不具蔥蒜味，胚珠數(shù)多，花被片下部靠合，鱗莖球狀或近球狀，單生，開紫花，花色艷麗，是園林造景中花境的好材料，植于石旁更具情趣。它是一類集菜用、調(diào)味、藥用、保健、飼用和防風(fēng)固沙為一體的多功能野菜植物[2]。野生蔥屬植物是重要的蔬菜植物，在民間，人們將嫩葉和鱗莖作涼拌菜、餡或湯食用，甚至花序也用作調(diào)制食物[3]。長梗韭含抗壞血酸（ascorbic acid），《蒙植藥志》記載，其鱗莖味辛、苦，性溫，有通陽散結(jié)、下氣之效，可用于胸悶刺痛、心絞痛、瀉痢后重、慢性氣管炎、咳嗽痰多等病癥的治療，鮮品可解河豚中毒。長梗韭又有消腫散瘀之功效，可用于治療跌打損傷、瘀血疼痛、腫脹、閃傷、扭傷[4]。

長梗韭富含多種營養(yǎng)元素，同時(shí)富含粗纖維。此外，長梗韭還有溫中行氣、散血解毒、保暖、健胃整腸等功效。長梗韭的觀賞、食用及藥用價(jià)值較高，但野生資源量在下降。目前，對(duì)長梗韭保護(hù)和開發(fā)利用的力度不夠，與其相關(guān)的研究十分缺乏且大多集中于染色體方面[5]。從野生長梗韭染色體數(shù)目和形態(tài)方面研究其分類學(xué)意義，認(rèn)為將長梗韭放在蔥屬合被組中更為合理[6]；通過引種栽培發(fā)現(xiàn)，長梗韭為二倍體2n-x2-16，其染色體帶有1 對(duì)中間隨體[7]；也有研究討論了隨體染色體的數(shù)目、形態(tài)變異及雜合現(xiàn)象在蔥屬進(jìn)化中的作用，認(rèn)為隨體染色體形態(tài)變異及雜合現(xiàn)象的出現(xiàn)是蔥屬中遺傳變異的重要源泉之一[8]。當(dāng)前對(duì)有關(guān)野生長梗韭種質(zhì)資源和遺傳多樣性的研究還非常欠缺。

ISSR 是一種雙親遺傳的核基因組分子標(biāo)記技術(shù)，操作簡單快速，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，能夠檢測到更多的變異位點(diǎn)等，且無需預(yù)知基因組序列信息，減少了多態(tài)性分析的預(yù)備工作。因此，這一分子標(biāo)記被越來越廣泛地應(yīng)用在研究瀕危珍稀物種的遺傳多樣性中[9-12]，真實(shí)地反映不同地理種群的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及種群之間的基因交流情況[12]。

為了合理地評(píng)估野生長梗韭的遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)狀況，并為該物種的保護(hù)提供參考依據(jù)，本研究采用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來自不同生境，分別是易縣林下耐陰環(huán)境和張家口草原干旱環(huán)境生長的長梗韭，進(jìn)行了生物學(xué)特性和遺傳多樣性方面的研究，分析長梗韭對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)性，以期為長梗韭資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

本研究所用材料取自野生的長梗韭，共用27 個(gè)樣品，其中：易縣樣本16 個(gè)，取自河北省保定市易縣千佛山林下，均為新長出的嫩葉；張家口樣本11 個(gè)，取自河北省張家口市塞北管理區(qū)干旱草地，也均是新長出的嫩葉。

圖1 河北壩上典型草原長梗韭（花期）

圖2 張家口壩上長梗韭（花期）

2 方法

2.1 野外考察

2014 年7－10 月底到河北省張家口和易縣進(jìn)行野外考察，觀察野生長梗韭的野外生長情況，記錄整理長梗韭的生物學(xué)特性值，并采集不同生境的材料用于遺傳差異分析。

2.2 ISSR 遺傳多樣性分析

2.2.1 基因組DNA 的提取。用試劑盒提取基因組DNA，將得到的樣品于冰箱-20℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆?。同時(shí)，為了得到非常直觀的效果，用1%的瓊脂糖電泳檢測DNA 的質(zhì)量；為了得到十分確切的DNA 濃度，用紫外分光光度計(jì)測量DNA 的OD 值。

2.2.2 ISSR 引物的選取。為了保證試驗(yàn)進(jìn)行的完整性，引物應(yīng)不止1 種，選取所需ISSR 引物，并請(qǐng)生物公司合成，表1 為所合成的引物。

表1 ISSR 引物

2.2.3 PCR 擴(kuò)增。按試驗(yàn)的退火溫度確定合適的PCR擴(kuò)增程序。按10mL 反應(yīng)體積，對(duì)模板DNA、Taq 酶、dNTP 和引物劑量分別進(jìn)行優(yōu)化篩選。經(jīng)多次試驗(yàn)比較，PCR 反應(yīng)最優(yōu)體系見表2（加超純水至10μL）。

表2 PCR 反應(yīng)最優(yōu)體系（10μL）

為了獲得最佳反應(yīng)體系，在PCR 儀上對(duì)Mg2+濃度、dNTPs 濃度、引物濃度、TaqDNA 聚合酶單位數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)篩選。體系優(yōu)化選用引物為ISSR-3（CCAGTGGTGGTGGTG），依照擴(kuò)增條帶強(qiáng)弱、主帶是否清晰與雜帶多少判斷體系的優(yōu)劣。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min；45℃復(fù)性1min；72℃延伸1.5min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸15min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在含有溴化乙錠（EB）的3%瓊脂糖凝膠中電泳分離，DNA 分子量標(biāo)記為DL 2000，以5V/cm 的電壓電泳1.5h。電泳結(jié)束后，在紫外分析儀上觀察擴(kuò)增條帶。

2.2.4 ISSR-PCR 產(chǎn)物的檢測。ISSR-PCR 產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳80min，電壓設(shè)定為100V，用EB 顯色，凝膠成像儀拍照記錄。

3 結(jié)果與分析

3.1 野外考察結(jié)果與分析

野外觀察測量2 種生境長梗韭的一些生物學(xué)特性值。由表3 分析可知，2 種長梗韭的生物學(xué)特性差異較大，尤其是花期、花色、花葶高度和葉片長度，都發(fā)生了顯著變化。因此，初步確定同一物種在不同的生境下發(fā)生了形態(tài)上的變化。有研究者對(duì)長梗韭進(jìn)行引種栽培，第1 年取原產(chǎn)地生長的鱗莖所發(fā)的根尖觀察，發(fā)現(xiàn)隨體染色體無任何雜合現(xiàn)象；第2 年取在新環(huán)境下生長的鱗莖所發(fā)的根尖觀察，發(fā)現(xiàn)隨體染色體首先作出反應(yīng)，發(fā)生變異產(chǎn)生了雜合，這是由自然條件發(fā)生了較大的變化而造成的[9]。事實(shí)上，植物種內(nèi)不同種群的差異大多由基因控制，基因?qū)π誀畹目刂破鹬鴽Q定性的作用，因此從分子水平研究遺傳多態(tài)性是否發(fā)生了變化更為可靠[13]。

表3 長梗韭各項(xiàng)生物學(xué)特性數(shù)值

3.2 ISSR 遺傳多樣性分析

3.2.1 試劑盒提取的基因組DNA 的電泳結(jié)果與分析。①經(jīng)DNA 的凝膠電泳檢測顯示，點(diǎn)樣孔不發(fā)亮，DNA主帶清晰，無彌散帶，無明顯的RNA 帶，說明質(zhì)量較高。②通過紫外分光光度計(jì)測量OD 值來測量提取的DNA 樣品濃度，26 個(gè)樣品中，DNA 濃度較為均一，在3～5mg/uL 之間。因?yàn)闈舛容^高，所以需要稀釋100 倍左右作為模板進(jìn)行PCR。

3.2.2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果與分析。通過引物優(yōu)化，從50 個(gè)引物中篩選出12 條擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)較強(qiáng)、背景清晰的引物用于2 個(gè)長梗韭群體DNA 樣品的擴(kuò)增。通過PCR 擴(kuò)增，獲得了70 條強(qiáng)度和清晰度均較好的條帶，每條單引物平均擴(kuò)增條帶數(shù)達(dá)6 條。擴(kuò)增條帶數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率在12 個(gè)引物中存在顯著差異。這些引物的擴(kuò)增片斷大小范圍在250～2000bp 之間。引物ISSR-3 在2 個(gè)長梗韭群體部分樣品中的擴(kuò)增電泳圖譜見圖3。如圖3 中箭頭所示，引物ISSR-3 共擴(kuò)增到9 條主帶，其中4 個(gè)條帶表現(xiàn)為多態(tài)性。

圖3 ISSR-3 引物對(duì)部分長梗韭樣品的擴(kuò)增結(jié)果

3.2.3 長梗韭遺傳差異分析。供試材料遺傳差異性分析結(jié)果如圖3 所示，根據(jù)條帶特異性不同，可知因?yàn)樯姝h(huán)境的不同，生活在壩上干旱草地的和生活在易縣林下的長梗韭遺傳基因已經(jīng)發(fā)生了變化，這種基因改變是否有利于其更好地適應(yīng)環(huán)境有待進(jìn)一步探究。因此，可通過POPGENE 軟件對(duì)2 種生境長梗韭遺傳變異進(jìn)行分析。

經(jīng)POPGENE 軟件分析，易縣長梗韭和張家口長梗韭2 個(gè)群體及其兩群體整體水平的遺傳多樣性指數(shù)見表4。分析可知，易縣長梗韭的遺傳多樣性水平與張家口長梗韭的遺傳多樣性水平不一樣，生境不同群落的遺傳多樣性發(fā)生了改變。

表4 2 個(gè)長梗韭群體的遺傳多樣性分析

如表5 所示，通過總基因多樣性（Ht）和群體內(nèi)基因多樣性（Hs）計(jì)算得到兩群體之間的基因分化系數(shù)Gst 為0.517，表明遺傳變異存在于種群內(nèi)，群體間的遺傳變異較大。經(jīng)群體遺傳分化分析，群體之間的Nm=0.4791＜1，說明易縣長梗韭和張家口長梗韭之間由于遺傳漂變而發(fā)生了分化。因此，可以斷定2 個(gè)種群間遺傳多樣性與環(huán)境有關(guān)，2 個(gè)生境的長梗韭基因發(fā)生了變化，同時(shí)在基因的表達(dá)過程中也發(fā)生了改變。

表5 2 個(gè)長梗韭群體基因多樣性Nei’s 分析

4 討論

4.1 長梗韭ISSR 反應(yīng)體系的優(yōu)化

有研究認(rèn)為，為了獲得重復(fù)性和可靠性較高的ISSR 譜帶，并提高分析的準(zhǔn)確性，對(duì)不同試驗(yàn)條件下的ISSR-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化是必要的[14]。應(yīng)用ISSR 技術(shù)研究植物遺傳差異需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，篩選出較穩(wěn)定的ISSR-PCR 的反應(yīng)體系。在優(yōu)化體系初始過程中，我們采用多次單因素設(shè)計(jì)的方法，因多種因素影響，試驗(yàn)周期較長，做了大量的PCR 擴(kuò)增，工作效率較低。另一種方法可采用數(shù)學(xué)分析，因?yàn)橛?jì)算較為復(fù)雜并且影響因素較多，難以較快實(shí)施，2 種方法都需要進(jìn)一步優(yōu)化。

4.2 遺傳差異性分析意義

遺傳差異性對(duì)一個(gè)物種適應(yīng)環(huán)境變化長期生存繁衍至關(guān)重要。為了合理制定瀕危物種的保護(hù)管理策略，應(yīng)對(duì)種群內(nèi)和種群間遺傳差異有較清晰的認(rèn)識(shí)[15]。本試驗(yàn)中的基因分化系數(shù)Gst 為0.5107，表明2 種生境長梗韭種群的遺傳結(jié)構(gòu)水平較低，這也表明群體間的遺傳變異占總體遺傳變異的相當(dāng)比例。因而，可以推測認(rèn)為，為了適應(yīng)環(huán)境的需求，不同群體的長梗韭的基因發(fā)生了改變。通過基因分化系數(shù)（Gst）推導(dǎo)出長梗韭群體之間每代遷移個(gè)體數(shù)（Nm）僅有0.4791，較低的Nm可能反映了這2 個(gè)長梗韭種群在歷史上沒發(fā)生過基因交流。因此，保護(hù)長梗韭需要盡可能地保護(hù)不同生境下的有效種群，這樣才能保護(hù)這個(gè)物種的遺傳多樣性。

本研究進(jìn)行的ISSR 遺傳變異分析表明兩群體的種群分化水平較高而基因流水平較低，兩地長梗韭在遺傳上差異較大。試驗(yàn)結(jié)果與杭焱等[10]的研究結(jié)論一致，表明ISSR 技術(shù)能應(yīng)用于不同地理種群的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及種群之間的基因交流情況方面的研究。長梗韭為研究較少的野生種，在2 種完全不同的生境中仍然能很好地生存，可以對(duì)此2 種生境的個(gè)體進(jìn)行基因測序，從基因的水平更好地研究植物抗旱耐濕的機(jī)制，這對(duì)我們將野生種的優(yōu)勢(shì)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)到傳統(tǒng)種植作物上有很大的幫助。同時(shí)，長梗韭作為野菜和藥用資源，研究其遺傳差異性，可為長梗韭保護(hù)方案提出合理性建議，為長梗韭品種改良與種質(zhì)資源創(chuàng)新提供依據(jù)，有助于了解物種的遺傳分化機(jī)制，對(duì)保護(hù)并進(jìn)一步合理利用長梗韭資源具有重要理論意義與實(shí)踐價(jià)值。