王 競，趙亞男，文 歡，劉為平，霍曉輝，范紅云

據(jù)GLOBOCAN最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年胃癌新發(fā)病例約103.3萬例，死亡病例約78.3萬例，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第5，病死率位居第3[1]。中國是胃癌高發(fā)國家，且存在明顯的地區(qū)差異。胃癌發(fā)病隱匿，易誤診，多數(shù)患者預(yù)后較差[2]。目前胃癌發(fā)病機(jī)制尚未明了，且缺乏有效的治療方法。環(huán)狀RNA(circRNA)和微小RNA(miR)是2類非編碼RNA，且circRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA與miR靶向結(jié)合，調(diào)控miR靶基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖和凋亡等生命活動(dòng)，參與腫瘤發(fā)展過程[3]。研究顯示，circ_0001946在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，沉默其表達(dá)可通過靶向miR-135a-5p/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)軸抑制癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲能力，其可能是結(jié)直腸癌治療的分子靶點(diǎn)[4]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中circ_0001946表達(dá)較低，circ_0001946過表達(dá)通過靶向miR-671-5p/CDR1軸降低體外膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，增加細(xì)胞凋亡，并抑制體內(nèi)異種移植瘤生長，提示其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中起抑癌作用[5]。Starbase靶基因在線軟件預(yù)測顯示，circ_0001946可能與miR-1270存在靶向調(diào)控關(guān)系，細(xì)胞周期蛋白T2(Cyclin T2)可能是miR-1270的靶基因。研究顯示，miR-1270在卵巢癌[6]、肺腺癌[7]、多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[8]和骨肉瘤[9]等腫瘤中表達(dá)降低，上調(diào)miR-1270表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞惡性表型，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)展。有報(bào)道稱，靶向抑制Cyclin T2表達(dá)可削弱胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并阻礙細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可作為促癌基因參與胃癌的發(fā)展進(jìn)程[10]。本研究檢測了胃癌組織和細(xì)胞系中circ_0001946與miR-1270的表達(dá)，并以miR-1270/Cyclin T2軸為切入點(diǎn)，探究circ_0001946對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1組織、細(xì)胞和試劑 45例胃癌組織及癌旁組織取自2017年6月—2019年12月在本院確診并行手術(shù)治療的胃癌患者，其中男25例、女20例，年齡(58.63±8.49)歲。正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞系(HGC-27、AGS、MKN45)，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、BCA蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，購自浙江天杭生物科技股份有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒，購自美國Invitrogen公司；PCR引物、circ_0001946小干擾RNA(si-circ_0001946)、小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、miR-1270抑制劑(anti-miR-1270)及陰性序列(anti-miR-NC)、miR-1270模擬物(mimics)及對(duì)照序列(miR-NC)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2研究方法

1.2.1qRT-PCR法檢測circ_0001946和miR-1270表達(dá)：將組織樣本在液氮保護(hù)下充分研磨，用RNA抽提試劑提取組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0001946相對(duì)于內(nèi)參GAPDH、miR-1270、U6的表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞系(HGC-27、AGS、MKN45)，均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將各對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，qRT-PCR法檢測細(xì)胞中circ_0001946和miR-1270表達(dá)，方法同“1.2.1”，選擇circ_0001946和miR-1270表達(dá)較GES-1細(xì)胞差異最顯著的胃癌細(xì)胞HGC-27進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)生長期HGC-27細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液。用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-NC(si-NC組)、si-circ_0001946(si-circ_0001946組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-1270 mimics(miR-1270組)、共轉(zhuǎn)染si-circ_0001946與anti-miR-NC(si-circ_0001946+anti-miR-NC組)、共轉(zhuǎn)染si-circ_0001946與anti-miR-1270(si-circ_0001946+anti-miR-1270組)。轉(zhuǎn)染12 h后，換為新鮮培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h，qRT-PCR法檢測細(xì)胞中circ_0001946或miR-1270表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，方法同“1.2.1”，并收集細(xì)胞備用。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(Control組)，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況：將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種至96孔板中(2.5×104個(gè)/孔)，分別培養(yǎng)24、48和72 h后加CCK-8 10 μl孵育2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測光密度(OD)值。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×104個(gè)/孔)，每2天換新鮮培養(yǎng)液1次。培養(yǎng)14 d后棄培養(yǎng)液，經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)超過50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.6Transwell法檢測細(xì)胞侵襲情況：將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞密度調(diào)至5.0×104個(gè)/ml。Transwell小室置于24孔板中，鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干。在上室中加細(xì)胞懸液100 μl，下室加培養(yǎng)液500 μl。培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野記數(shù)細(xì)胞侵襲情況。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：由生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)Starbase靶基因在線軟件預(yù)測的miR-1270與circ_0001946或Cyclin T2結(jié)合位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)并合成circ_0001946、Cyclin T2的野生型熒光素酶載體(WT-circ_0001946、WT-Cyclin T2)及突變型熒光素酶載體(MUT-circ_0001946、MUT-Cyclin T2)。將HGC-27細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染miR-1270 mimics與WT-circ_0001946或WT-Cyclin T2、miR-NC與WT-circ_0001946或WT-Cyclin T2、miR-1270 mimics與MUT-circ_0001946或MUT-Cyclin T2、miR-NC與MUT-circ_0001946或MUT-Cyclin T2。轉(zhuǎn)染12 h后，換新鮮培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞并裂解。3500 r/min離心5 min后取上清，檢測熒光素酶活性。

1.2.8蛋白免疫印跡法檢測Cyclin T2蛋白表達(dá)：將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)48 h后用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白。經(jīng)BCA定量、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，分別用Cyclin T2(1︰500)和GAPDH(1︰1000)一抗4℃孵育過夜。洗膜后，用山羊抗兔二抗(1︰1000)37℃孵育2 h。顯影液避光顯影，凝膠系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析Cyclin T2對(duì)于GAPDH表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織中circ_0001946與miR-1270表達(dá)及相關(guān)性 胃癌組織中circ_0001946表達(dá)高于癌旁組織(2.65±0.18 vs 1.00±0.06)，而miR-1270表達(dá)低于癌旁組織(0.26±0.06 vs 1.00±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中circ_0001946與miR-1270表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.752，P<0.05)。見圖1。

圖1 胃癌組織中circ_0001946與miR-1270表達(dá)及相關(guān)性A.胃癌組織中circ_0001946和miR-1270的表達(dá)水平，與癌旁組織比較，aP<0.05；B.胃癌組織中circ_0001946與miR-1270表達(dá)的相關(guān)性

2.2胃癌細(xì)胞系中circ_0001946與miR-1270表達(dá)情況 胃癌細(xì)胞系(HGC-27、AGS、MKN45)中circ_0001946表達(dá)高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1(2.81±0.17、1.43±0.08、2.08±0.15 vs 1.00±0.01)，而miR-1270表達(dá)低于GES-1細(xì)胞(0.29±0.07、0.79±0.09、0.52±0.09 vs 1.00±0.00)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 胃癌細(xì)胞系中circ_0001946與miR-1270的表達(dá)與GES-1細(xì)胞比較，aP<0.05

2.3circ_0001946過表達(dá)對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響 si-circ_0001946組胃癌HGC-27細(xì)胞中circ_0001946表達(dá)量低于Contorl組和si-NC組(P<0.05)，表明敲減circ_0001946的HGC-27細(xì)胞構(gòu)建成功,見圖3。si-circ_0001946組HGC-27細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)和侵襲數(shù)低于Contorl組和si-NC組，凋亡率高于Contorl組和si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Contorl組與si-NC組各檢測指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4～7及表1。

表1 敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞克隆、凋亡和侵襲能力的影響

圖3 胃癌HGC-27細(xì)胞si-circ_0001946轉(zhuǎn)染效果與Control組比較，aP<0.05；與si-NC組比較，bP<0.05

圖4 敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞OD值的影響OD為光密度；與Control組比較，aP<0.05；與si-NC組比較，bP<0.05

2.4miR-1270過表達(dá)對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響 miR-1270組胃癌HGC-27細(xì)胞中miR-1270表達(dá)量高于Control組和miR-NC組(P<0.05)，表明miR-1270過表達(dá)的HGC-27細(xì)胞構(gòu)建成功，見圖8。miR-1270組HGC-27細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)和侵襲數(shù)低于Control組和miR-NC組(P<0.05)，凋亡率高于Control組和miR-NC組(P<0.05)，而Control組與miR-NC組各檢測指標(biāo)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖9～12及表2。

圖5 敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞克隆形成數(shù)的影響(×10)

圖6 敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞凋亡的影響

圖7 敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲的影響(×100)

圖8 胃癌HGC-27細(xì)胞miR-1270 mimics轉(zhuǎn)染效果與Control組比較，aP<0.05；與miR-NC組比較，bP<0.05

圖9 miR-1270過表達(dá)對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞OD值的影響OD為光密度；與Control組比較，aP<0.05；與miR-NC組比較，bP<0.05

圖10 miR-1270過表達(dá)對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞克隆形成數(shù)的影響(×10)

圖11 miR-1270過表達(dá)對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞凋亡的影響

圖12 miR-1270過表達(dá)對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲的影響(×100)

表2 miR-1270過表達(dá)對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞克隆、凋亡和侵襲能力的影響

2.5敲減miR-1270抑制敲減circ_0001946對(duì)胃癌細(xì)胞的影響 si-circ_0001946+anti-miR-1270組胃癌HGC-27細(xì)胞miR-1270表達(dá)量低于si-circ_0001946+anti-miR-NC組(P<0.05)，細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)和侵襲數(shù)高于si-circ_0001946+anti-miR-NC組(P<0.05)，凋亡率低于si-circ_0001946+anti-miR-NC組(P<0.05)，而si-circ_0001946組與si-circ_0001946+anti-miR-NC組各指標(biāo)無差異(P>0.05)。見圖13～17及表3。

表3 敲減miR-1270抑制敲減circ_0001946對(duì)胃癌細(xì)胞克隆、凋亡和侵襲能力的影響

圖13 胃癌HGC-27細(xì)胞anti-miR-1270轉(zhuǎn)染效果與si-NC組比較，aP<0.05；與si-circ_0001946+anti-miR-NC組比較，bP<0.05

2.6circ_0001946對(duì)miR-1270/Cyclin T2的影響 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-1270與WT-circ_0001946或WT-Cyclin T2共轉(zhuǎn)染后的胃癌HGC-27細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而與MUT-circ_0001946或MUT-Cyclin T2共轉(zhuǎn)染后的胃癌HGC-27細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。見圖18。si-circ_0001946組胃癌HGC-27細(xì)胞中miR-1270表達(dá)高于Control組和si-NC組(P<0.05)，而Cyclin T2蛋白表達(dá)低于Control組和si-NC組(P<0.05)。miR-1270組胃癌HGC-27細(xì)胞中Cyclin T2蛋白表達(dá)低于Control組和miR-NC組(P<0.05)，而si-circ_0001946+anti-miR-1270組HGC-27細(xì)胞中Cyclin T2蛋白表達(dá)高于si-circ_0001946+anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖19、20。

圖14 敲減miR-1270抑制敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞OD值的影響OD為光密度；與si-NC組比較，aP<0.05；與si-circ_0001946+anti-miR-NC組比較，bP<0.05

圖15 敲減miR-1270抑制敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞克隆形成數(shù)的影響(×10)

圖16 敲減miR-1270抑制敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞凋亡的影響

圖17 敲減miR-1270抑制敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲的影響(×100)

圖18 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果與miR-NC組比較，aP<0.05

圖19 敲減circ_0001946對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞miR-1270表達(dá)的影響與Control組比較，aP<0.05；與si-NC組比較，bP<0.05

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)[11-12]，其中原癌基因的激活與抑癌基因的失活在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[13]。circRNA呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有較高的穩(wěn)定性和保守性，在真核生物中廣泛存在。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)腫瘤中存在大量異常表達(dá)的circRNA，這些異常表達(dá)的circRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性表型，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

已有研究表明，circ_0032627[14]、circ-ZNF609[15]、circ-CCDC66[16]等多種circRNA在胃癌中表達(dá)升高，促進(jìn)了胃癌的發(fā)展進(jìn)程。作為一種circRNA，circ_0001946參與了多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。有報(bào)道稱，circ_0001946在肺腺癌組織和細(xì)胞系中均過表達(dá)，敲減其表達(dá)可通過靶向miR-135a-5p/SIRT1軸抑制癌細(xì)胞生長，提示其可能是治療肺腺癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[17]。本研究首先采用qRT-PCR技術(shù)檢測了胃癌組織及細(xì)胞系中circ_0001946的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，circ_0001946在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)升高，提示其可能促進(jìn)了胃癌的發(fā)展進(jìn)程；通過干擾胃癌細(xì)胞中circ_0001946的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)干擾circ_0001946能夠顯著削弱胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，提示circ_0001946也有可能成為胃癌治療的分子靶點(diǎn)。

圖20 circ_0001946靶向miR-1270調(diào)控胃癌HGC-27細(xì)胞中Cyclin T2蛋白基因表達(dá)情況A為Control組，B為si-NC組，C為si-circ_0001946組，D為miR-NC組，E為miR-1270組，F(xiàn)為si-circ_0001946+anti-miR-NC組，G為si-circ_0001946+anti-miR-1270組；與Control組比較，aP<0.05；與si-NC組比較，bP<0.05；與miR-NC組比較，cP<0.05；與si-circ_0001946+anti-miR-NC組比較，dP<0.05

為探究敲減circ_0001946抑制胃癌細(xì)胞惡性表型的分子機(jī)制，本研究利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了circ_0001946可競爭性結(jié)合miR-1270，同時(shí)敲減circ_0001946可促進(jìn)胃癌細(xì)胞中miR-1270的表達(dá)，這與本文胃癌組織中circ_0001946與miR-1270表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果相一致。miR-1270參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，且在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同。有報(bào)道稱，circ_0001247在宮頸癌中表達(dá)升高，其通過競爭性結(jié)合miR-1270上調(diào)ZEB2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，減少癌細(xì)胞凋亡[18]；circ_103809在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，干擾circ_103809可通過靶向miR-1270/PLAGL2軸抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及EMT過程[19]。miR-1270在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系和腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移[20]。本研究結(jié)果顯示，miR-1270在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)降低， miR-1270過表達(dá)可有效阻礙胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，并加劇胃癌細(xì)胞凋亡，說明miR-1270在胃癌的發(fā)展中起抑制作用。本研究結(jié)果還顯示，敲減miR-1270可抑制敲減circ_0001946對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響，提示circ_0001946可能通過靶向結(jié)合miR-1270影響胃癌細(xì)胞的惡性表型。

Cyclin T2是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其可與CDK9結(jié)合形成異二聚體后活化轉(zhuǎn)錄延長促進(jìn)因子P-TEFb，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖。研究顯示，胃癌組織中miR-142-3p表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可通過靶向抑制Cyclin T2的表達(dá)降低胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[21]。本研究證實(shí)了Cyclin T2是miR-1270的靶基因，且敲減circ_0001946或miR-1270過表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞中Cyclin T2的表達(dá)，且敲減miR-1270可降低敲減circ_0001946對(duì)胃癌細(xì)胞Cyclin T2表達(dá)的抑制作用，進(jìn)一步提示circ_0001946可通過靶向結(jié)合miR-1270進(jìn)而調(diào)控Cyclin T2的表達(dá)。

綜上，circ_0001946在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，敲減其表達(dá)可有效阻礙胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，其可能通過競爭性結(jié)合miR-1270并調(diào)控Cyclin T2來影響胃癌細(xì)胞的惡性表型，有可能成為胃癌治療的分子靶點(diǎn)。