吳淑慧，於洪建，於 天，鄭志剛，柯 達(dá)，趙 玲,

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023；2.無(wú)錫市世紀(jì)生物工程有限公司，江蘇無(wú)錫 214000；3.天津益倍元天然產(chǎn)物技術(shù)有限公司，天津 300000）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）是體內(nèi)尿酸生成增加或尿酸排泄減少而導(dǎo)致尿酸水平高于正常值的一種代謝性疾病[1]。高尿酸血癥不僅是引發(fā)痛風(fēng)[2]的關(guān)鍵生化指標(biāo)，還與糖尿病[3]、高血壓[4]、慢性腎病[5]、冠心病[6]等疾病密切相關(guān)。尿酸是黃嘌呤和次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶（XOD）的參與下代謝的最終產(chǎn)物，而在尿酸的排泄過(guò)程中，超過(guò)70%的尿酸會(huì)通過(guò)腎臟排泄[7]，黃嘌呤氧化酶異常上調(diào)導(dǎo)致嘌呤代謝受阻和尿酸生成增多[8]。目前臨床西藥治療高尿酸血癥藥物主要有抑制尿酸生成藥、促進(jìn)尿酸排泄藥和促進(jìn)尿酸溶解藥三類[9]，其中一線治療藥物別嘌呤醇為黃嘌呤氧化酶抑制劑，通過(guò)抑制尿酸生成而達(dá)到降尿酸的目的，但臨床上只有不到一半患者可以控制其尿酸水平，且別嘌呤醇的不良反應(yīng)與HLAB*5801等位基因陽(yáng)性率有相關(guān)性，有國(guó)際組織報(bào)道華人對(duì)HLA-B*5801的攜帶率較高[10]，因而限制了別嘌呤醇的使用；促進(jìn)尿酸排泄藥物苯溴馬隆是通過(guò)抑制腎小管對(duì)尿酸的重吸收，從而降低血中尿酸濃度，臨床用藥發(fā)現(xiàn)苯溴馬隆長(zhǎng)期服用會(huì)造成肝腎損傷[11]，因而尋找到一種副作用小且可安全使用的天然藥物具有重大意義。

藤茶為顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang）的嫩莖葉，始載于《茶經(jīng)》，是葡萄科蛇葡萄屬多年生木質(zhì)藤本植物[12]，主要分布于我國(guó)湖南、湖北、云南、貴州、廣東、廣西、福建等長(zhǎng)江以南各省[13]。藤茶即可入藥也可食用，民間用其嫩莖葉入茶已有數(shù)百年的歷史。據(jù)《中草藥匯編》等文獻(xiàn)記載，藤茶入藥有清熱解毒的功效，可治療感冒風(fēng)熱、咽喉腫痛等[14]?，F(xiàn)代研究表明，藤茶及其提取物具有抗炎[15]、抗菌[16]、抗氧化[17]、降血糖[18]、降血脂[19]、降壓[20]等多種藥理活性。本實(shí)驗(yàn)使用藤茶提取物灌胃氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠模型，對(duì)藤茶提取物降尿酸作用進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)藤茶提取物的降尿酸水平及對(duì)肝臟和腎臟組織的影響，為開(kāi)發(fā)藤茶降尿酸作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)雄性ICR小鼠 體質(zhì)量（18~22 g），斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010；藤茶提取物（50%的二氫楊梅素和5%的槲皮素） 無(wú)錫市世紀(jì)生物工程有限公司；別嘌呤醇（批號(hào)：20180305） 世貿(mào)天階制藥（江蘇）有限責(zé)任公司；氧嗪酸鉀（批號(hào)：O0164） 武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、黃嘌呤氧化酶（XOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Enspire酶標(biāo)儀 美國(guó)PerkinElmer；FC5515R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)OHAUS；EL-104 分析天平

瑞士梅特勒-托利多；HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海皓莊儀器；Eclipse Ci熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高尿酸血癥小鼠模型建立 12只ICR雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組（NC）和模型組（MC），每組6只。第8 d上午，模型組腹腔注射給藥氧嗪酸鉀（用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成12 mg/mL乳懸液）進(jìn)行造模，注射體積為10 g/0.1 mL，連續(xù)7 d以制備高尿酸血癥模型。造模7 d后，給藥1 h后，對(duì)小鼠進(jìn)行眼內(nèi)眥靜脈采血，4 ℃下靜置1 h，3500 r/min離心15 min分離血清，待用。

1.2.2 給藥方法 以建立的HUA小鼠模型為基礎(chǔ)，將48只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC）、模型對(duì)照組（MC）、別嘌呤醇組（ALLO）、藤茶提取物低（L）、中（M）、高（H）劑量組，共6組，每組8只。確定別嘌呤醇給藥劑量為10 mg/kg/d，藤茶提取物低、中、高劑量組對(duì)應(yīng)濃度分別為100、200、400 mg/kg/d。第8~14 d期間，正常組注射生理鹽水，其余組注射等體積（300 mg/kg）氧嗪酸鉀造模。第15~28 d期間，在正常組與其余各組分別注射生理鹽水和氧嗪酸鉀1 h后，別嘌呤醇組和藤茶提取物給藥組分別灌胃相應(yīng)劑量別嘌呤醇和藤茶提取物，其中正常組和模型組灌胃等體積（10 g/0.1 mL）生理鹽水。

1.2.3 小鼠體重相對(duì)變化率 每天觀察小鼠的一般情況并在給藥前對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，計(jì)算每只小鼠的體重相對(duì)變化率（%）=（每日稱量體重/實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前體重）×100

1.2.4 小鼠肝腎系數(shù) 小鼠頸脫臼處死后取其肝臟和腎臟進(jìn)行稱量，計(jì)算各組小鼠的肝腎系數(shù)，肝腎系數(shù)（mg/g）=小鼠臟器（mg）/小鼠體重（g）。

1.2.5 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥1 h后，對(duì)小鼠進(jìn)行摘眼球取血，取血0.5 mL，低溫靜置1 h后，3500 r/min離心15 min分離血清；取腎臟和肝臟，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，病理組織學(xué)檢測(cè)；準(zhǔn)確稱取肝臟，按試劑盒說(shuō)明書(shū)制備肝臟勻漿。按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定各組小鼠血清中尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x ˉ±s）表示，組間比較用單因素方差分析，考察各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量相對(duì)變化率情況

圖1 顯示，各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間，體重相對(duì)變化率情況總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但與正常組相比，各組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），說(shuō)明別嘌呤醇和藤茶提取物對(duì)小鼠生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

圖 1 小鼠體重相對(duì)變化率情況Fig.1 Relative change rate of mice body weight

2.2 小鼠肝腎系數(shù)

藤茶提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠臟器系數(shù)的影響見(jiàn)表1。與正常組比較，模型組小鼠的肝臟、腎臟系數(shù)均有所上升，肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)具有顯著水平（P<0.05）。與模型組相比，別嘌呤醇組肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)顯著降低（P<0.05），藤茶提取物組肝臟、腎臟系數(shù)均有所降低，其中200和400 mg/kg藤茶提取物組腎臟指數(shù)有顯著性差異（P<0.05）。說(shuō)明藤茶提取物有降低高尿酸血癥小鼠肝臟、腎臟指數(shù)的作用。

表 1 藤茶提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠臟器系數(shù)的影響Table 1 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on organ coefficient of HUA mice

2.3 對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸（UA）的影響

與正常組相比，模型組組血清尿酸值極顯著增加40.3%（P<0.01）；與模型組相比，灌胃200和400 mg/kg藤茶提取物后，小鼠血清尿酸值分別降低22.65%（P<0.05）和29.15%（P<0.01），別嘌呤醇組血清尿酸水平顯著降低69.15%（P<0.01），灌胃100 mg/kg藤茶提取物有降低小鼠血清尿酸值但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是因?yàn)?00 mg/kg藤茶提取物的血藥濃度達(dá)不到降低血尿酸的作用，見(jiàn)圖2。綜上，灌胃不同劑量藤茶提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的降尿酸作用明顯差異，200和400 mg/kg藤茶提取物有良好降尿酸效果。

圖 2 藤茶提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸值的影響Fig.2 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on serum uric acid value in HUA mice

圖 3 藤茶提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清肌酐和尿素氮含量的影響Fig.3 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on serum CRE and BUN in HUA mice

2.4 對(duì)高尿酸血癥小鼠血清肌酐（CRE）和尿素氮（BUN）的影響

血清肌酐和尿素氮均通過(guò)腎臟進(jìn)行代謝，臨床上常用來(lái)評(píng)估腎臟損傷程度[21]。藤茶提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清肌酐和尿素氮含量的影響見(jiàn)圖3。與正常組相比，模型組肌酐和尿素氮水平顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，灌胃100和200 mg/kg藤茶提取物降低肌酐水平（P<0.05），200 mg/kg藤茶提取物顯著降低尿素氮水平（P<0.01），400 mg/kg藤茶提取物顯著降低肌酐和尿素氮水平（P<0.01）；與模型組相比，別嘌呤醇組顯著降低尿素氮水平（P<0.01），肌酐水平有降低，但無(wú)顯著差別。

圖 4 藤茶提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清AST和AST含量的影響Fig.4 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on serum AST and ALT in HUA mice

2.5 對(duì)高尿酸血癥小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量的影響

AST和ALT為臨床上診斷肝臟受損程度指標(biāo)，肝細(xì)胞膜通透性增加或肝細(xì)胞壞死均可導(dǎo)致ALT和AST水平升高[22]。藤茶提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清 AST 和 AST含量的影響見(jiàn)圖4。與正常組相比，模型組小鼠血清AST、ALT含量極顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，灌胃100和200 mg/kg藤茶提取物可顯著降低AST含量（P<0.05），400 mg/kg藤茶提取物可極顯著降低AST含量（P<0.01）；灌胃100 mg/kg藤茶提取物可顯著降低ALT含量（P<0.05），200和400 mg/kg藤茶提取物可極顯著降低ALT含量（P<0.01）；別嘌呤醇組可降低AST、ALT含量（P<0.05）。說(shuō)明藤茶提取物可降低AST、ALT含量，且具有劑量依賴性。

2.6 對(duì)小鼠肝臟組織XOD活性的影響

圖5 表明，與正常組相比，模型組小鼠肝臟組織中XOD活性極顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，別嘌呤醇給藥組小鼠肝臟XOD活性極顯著降低（P<0.01）；灌胃200 mg/kg藤茶提取物可顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟組織XOD活性（P<0.05），灌胃400 mg/kg藤茶提取物可極顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟組織XOD活性（P<0.01）。說(shuō)明藤茶提取物可以降低高尿酸血癥小鼠肝臟組織XOD活性。

圖 5 藤茶提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟組織XOD活性的影響Fig.5 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on XOD activities in HUA mice

2.7 小鼠腎組織病理變化

如圖6可見(jiàn)，正常組小鼠腎小管細(xì)胞整體排列緊密，形態(tài)正常且飽滿，腎小球結(jié)構(gòu)清楚；模型組小鼠腎小球數(shù)量未見(jiàn)明顯差異，腎小管上皮細(xì)胞空泡變形，輕度炎癥浸潤(rùn)；與模型組相比，別嘌呤醇組小鼠腎小管官腔擴(kuò)張明顯，腎小球萎縮變形，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；藤茶提取物各劑量組小鼠腎小管形態(tài)與模型組相比輕微改善。

2.8 小鼠肝組織病理變化

由圖7所示，各組肝細(xì)胞形態(tài)正常，與空白組相比，模型組小鼠肝細(xì)胞伴隨輕度水腫；與模型組相比，別嘌呤醇組小鼠肝細(xì)胞伴隨輕度水腫和輕微炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；藤茶提取物各劑量組小鼠肝細(xì)胞無(wú)壞死且正常。

圖 6 AGE對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠腎臟的影響（200×）Fig.6 Effects of AGE on the influence of kidney in hyperuricemia mice induced by potassium oxonate（200×）

圖 7 AGE對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠肝臟的影響（200×）Fig.7 Effects of AGE on the influence of liver in hyperuricemia mice induced by potassium oxonate (200×)

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，由于生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，高尿酸血癥已成為威脅現(xiàn)代人健康的常見(jiàn)疾病[23]。有研究表明高尿酸血癥患者的患病率逐年升高，而長(zhǎng)期的血尿酸水平過(guò)高，不僅引起痛風(fēng)、腎臟病變和代謝性疾病，患者的AST、ALT等指標(biāo)水平也高于正常人，其原因可能是尿酸水平通過(guò)引起胰島素抵抗而致代謝性疾病[24]。黃嘌呤氧化酶廣泛存在于哺乳動(dòng)物肝臟中，是嘌呤代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在尿酸調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，尿酸是由黃嘌呤氧化酶氧化次黃嘌呤所產(chǎn)生的，再經(jīng)由腎小管排出體外[25?28]。氧嗪酸鉀為一種尿酸酶抑制劑，可特異性阻止尿酸降解，從而升高血清尿酸水平[29]。本實(shí)驗(yàn)選用氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠模型[30]，模型組血尿酸值與正常組相比升高40.3%，表明造模成功。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型相比，藤茶提取物各劑量組對(duì)高尿酸血癥小鼠的血尿酸含量有明顯的降低作用，且不同濃度藤茶提取物的降尿酸效果表現(xiàn)為：400>200>100 mg/kg藤茶提取物。血清肌酐和尿素氮用來(lái)反映腎功能情況，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶則可反映肝功能情況，與正常組相比，模型組血清CRE、BUN、AST、ALT和肝臟XOD含量極顯著升高（P<0.01），肝腎系數(shù)上升，說(shuō)明持續(xù)的高尿酸水平可能對(duì)腎功能和肝功能產(chǎn)生損傷；與模型組相比，藤茶提取物能明顯降低血清CRE、BUN、AST、ALT和肝臟XOD水平，同時(shí)肝腎系數(shù)下降，表明藤茶提取物對(duì)肝臟和腎臟有保護(hù)作用。藤茶提取物給藥組能夠降低血清尿酸水平可能是通過(guò)降低XOD含量，從而減少尿酸生成或促進(jìn)尿酸排泄，進(jìn)而達(dá)到降尿酸的效果。病理組織學(xué)形態(tài)檢查發(fā)現(xiàn)，別嘌呤醇組的腎組織細(xì)胞有明顯空泡變化，肝臟細(xì)胞有輕微水腫和炎癥浸潤(rùn)，而藤茶提取物給藥組對(duì)肝腎組織損傷明顯小于別嘌呤醇，說(shuō)明藤茶提取物給藥組能夠有效改善因高尿酸血癥而導(dǎo)致的肝腎功能損傷。

綜上，藤茶提取物能夠明顯降低氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平，且作用與劑量有正相關(guān)趨勢(shì)。其機(jī)制可能是通過(guò)降低小鼠肝臟XOD活性，從而降低血清尿酸水平，同時(shí)對(duì)肝腎組織有明顯保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究探索，為開(kāi)發(fā)藤茶降尿酸作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。