巫婷玉，徐芳玲 ，葉蔚歆，虞春華，馬 嫚，陳 曄

（1.江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江西上饒 334000；2.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西九江 332000；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣東廣州 510000）

豆腐乳是中國流傳數(shù)千年的漢族傳統(tǒng)民間美食，豆腐乳以它的口味鮮美、風(fēng)味獨特、質(zhì)地細(xì)膩、營養(yǎng)豐富而著稱，被稱之為“東方奶酪”，是我國著名的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制調(diào)味品之一。發(fā)酵豆制品的整個生產(chǎn)過程被認(rèn)為是一個開放的、傳統(tǒng)的過程，整個發(fā)酵過程中有多種微生物共同參與，不同微生物所起的作用可能各不相同。

豆腐乳作為發(fā)酵食品，目前研究發(fā)現(xiàn)豆腐乳中真菌有毛霉屬（Mucor）[1?2]、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、根霉屬（Rhizopus）[3]、地霉屬（Geotrichum）、鐮刀孢屬（Fusarium）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、酵母屬（Saccharomyces）、耶羅維亞酵母屬（Yarrowia）等微生物[4?6]；微生物在豆腐乳的生產(chǎn)、揮發(fā)性風(fēng)味、品質(zhì)等方面具有影響，國內(nèi)外不同地方[7?9]以及不同風(fēng)味的豆腐乳中微生物多樣性研究[10?12]表明，豆腐乳中具有豐富的真菌資源，如低鹽[13?14]、紅豆腐乳[15]、傳統(tǒng)發(fā)酵的豆腐乳[16?17]中的真菌資源均很豐富。

上饒位于江西省東北部，氣候溫濕，適合真菌的生存。由于當(dāng)?shù)氐娘L(fēng)俗習(xí)慣，每年春節(jié)將近家家戶戶都會制作豆腐乳。相對于工廠里具有嚴(yán)格的安全管理，家庭自制發(fā)酵豆腐乳具有更高的危害性，由于自制豆腐乳開放式的制作環(huán)境，豆腐乳中其它雜霉菌和細(xì)菌存在的幾率很高。這些霉菌的存在對于豆腐乳風(fēng)味的形成可能具有一定的有益作用，同時也可能是有害菌株，在發(fā)酵過程中產(chǎn)毒，造成多種微量毒素共存的現(xiàn)象[18?22]。因此，為了讓百姓了解自制發(fā)酵豆腐乳的危害性，更好地改善自制豆腐乳的品質(zhì)，本文以自然發(fā)酵豆腐乳為材料，采用稀釋平板培養(yǎng)方法，結(jié)合形態(tài)特征和LSU序列測序進行菌株鑒定探究上饒不同地區(qū)豆腐乳真菌的多樣性。研究結(jié)果將有助于進一步了解家庭自制自然發(fā)酵豆腐乳真菌毒素的檢測，為家庭自制豆腐乳安全性提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

自然發(fā)酵豆腐乳 來自江西上饒市的八個鄉(xiāng)村；分離培養(yǎng)基 虎紅培養(yǎng)基（蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂19 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素0.1 g、蒸餾水1000 mL）；純化、保種培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基。

LT302電子天平、DYY-2C型電泳儀 北京市六一儀器廠；紫外分析儀、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、基因擴增儀 上海啟前電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料采集和處理 于2018年4月分別在江西上饒市八個鄉(xiāng)村進行了自然發(fā)酵豆腐乳樣本采集（具體采樣地點為：A：婺源縣溪頭鄉(xiāng)呈川村；B：廣豐區(qū)洋口鎮(zhèn)；C：鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村；D：玉山縣樟村鎮(zhèn)；E：德興市紅山生活區(qū)；F：上饒縣田墩鎮(zhèn)；G鉛山縣石塘周邊；H：廣豐區(qū)小康城安利小區(qū)。在文中圖表用不同英文字母來表示不同采樣點）。在每個采樣點分別采集3家自然發(fā)酵豆腐乳放入無菌瓶中（每瓶150 g），并用無菌自封袋密封帶回實驗室于4 ℃保存，對樣品進行處理培養(yǎng)。

1.2.2 真菌分離純化 采用稀釋涂布平板法。樣品稀釋液的制備：準(zhǔn)確稱取待測樣品l0 g，放入研缽中，加入90 mL蒸餾水，進行研磨，使微生物細(xì)胞分散，再在虎紅培養(yǎng)基上進行涂布，將平板倒置，進行標(biāo)號，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5~7 d，每天觀察。做三個平行實驗，每一個平行實驗中每個稀釋濃度涂布五個平板。

當(dāng)培養(yǎng)基上長出菌絲后，通過不同菌落的形態(tài)特征進行區(qū)分，用無菌接種針分別挑取不同菌落的菌絲接到PDA培養(yǎng)基上，繼續(xù)25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5 d，進行純化培養(yǎng)，直到獲得單一的菌種[23]。純化得到的菌株進行分離鑒定，并采用甘油管保藏法置于?20 ℃于保存。

1.2.3 真菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、菌絲和產(chǎn)孢器結(jié)構(gòu)的形態(tài)查閱《真菌鑒定手冊》[24]、Barnett & hunter（1998）和Seifert et al.（2011）的分類系統(tǒng)鑒定到屬。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)菌落的培養(yǎng)特征及微觀特征進行形態(tài)型的劃分合并，通過選取具有代表性的形態(tài)型菌株，分別刮取在PDA上培養(yǎng)成熟的菌絲，利用氯化芐法提取DNA[25]。采用真菌引物L(fēng)R0R（5’-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3’）和LR5（5’-TTAAAAAGCTCGTAGTTGAAC-3’）對菌株進行PCR擴增LSU片段[26]，獲得的擴增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進行序列測定。測得序列經(jīng)峰圖檢查并在NCBI中進行同源性比對[27]。確保序列準(zhǔn)確性后，將本研究獲得序列和從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的相關(guān)序列利用MEGA 10.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 實驗數(shù)據(jù)公式

1.2.4.1 菌落總數(shù)（colonies number）的計算

式中：C表示某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；m表示涂布平板時所用豆腐乳的質(zhì)量，g；M表示稀釋倍數(shù)。

1.2.4.2 分離頻率（isolation frequency，IF）的計算

1.2.4.3 Shannon-Wiener指數(shù)（H）的計算

式中：pi表示為種i真菌菌株數(shù)目與全部真菌菌株數(shù)目的比值。

1.2.4.4 Jaccard相似性指數(shù)（Cj）的計算[28]

式中：a表示一個地區(qū)豆腐乳分離的真菌的屬數(shù)；b表示另一個地區(qū)豆腐乳分離的真菌的屬數(shù)；c表示兩個地區(qū)豆腐乳具有的相同真菌屬數(shù)；Cj表示兩個地區(qū)豆腐乳之間真菌的屬組成的相似程度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Origin75漢化版軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆腐乳中菌落數(shù)的比較

豆腐乳中每樣品中的菌落數(shù)（表1），豆腐乳中的真菌數(shù)量較多。在同一稀釋濃度下，不同的地區(qū)的豆腐乳中真菌數(shù)有較大的差異，在稀釋濃度為10?3時，鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村、廣豐區(qū)洋口鎮(zhèn)、婺源縣溪頭鄉(xiāng)呈川村每克樣品中的菌落數(shù)明顯高于其他五個地區(qū)；在稀釋濃度為10?4時，鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村、上饒縣田墩鎮(zhèn)、廣豐區(qū)小康城安利小區(qū)、婺源縣溪頭鄉(xiāng)呈川村的每克樣品中的菌落數(shù)明顯高于其他四個地區(qū)；在稀釋濃度為10?5時，鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村、廣豐區(qū)洋口鎮(zhèn)、鉛山縣石塘周邊的每克樣品中的菌落數(shù)明顯高于其他五個地區(qū)；說明鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村、廣豐區(qū)洋口鎮(zhèn)、鉛山縣石塘周邊三個地區(qū)的菌株豐富度較高。

表 1 每克樣品中的菌落數(shù)Table 1 Number of colonies per gram of sample

2.2 豆腐乳中真菌主要類群組成

從上饒市八個地區(qū)自制豆腐乳樣品中共分離227個菌株，根據(jù)形態(tài)特征，形態(tài)型菌株LSU序列的相似性比較和分子發(fā)育分析將227株菌株劃分Aspergillus、Penicillium、Talaromyces等26個分類單元（表2）。從屬級水平的分離頻率來看，以Penicillium（29.04%）、Aspergillus（24.65%）、Talaromyces（22.88%）、Fusarium（10.57%）為優(yōu)勢菌群；同時可知Penicillium為婺源縣溪頭鄉(xiāng)呈川村、鉛山縣石塘周邊、廣豐區(qū)洋口鎮(zhèn)的共同優(yōu)勢菌群，Talaromyces為廣豐區(qū)小康城安利小區(qū)和上饒縣田墩鎮(zhèn)的共同優(yōu)勢菌群，而德興市紅山生活區(qū)的優(yōu)勢菌群為Penicillium和Aspergillum，鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村的優(yōu)勢菌群為Aspergillus，玉山縣樟樹鎮(zhèn)的優(yōu)勢菌群為Fusarium。

表 2 上饒地區(qū)自制豆腐乳真菌菌群組成Table 2 Composition of fermented soybean curd fungus in Shangrao area

從種級水平的分離頻率來看：在八個地區(qū)中，以Aspergillus niger（12.77%）、Penicillium pulvillorum（11.00%）、Talaromyces albobiverticillius（10.12%）為優(yōu)勢菌群；在各個地區(qū)的優(yōu)勢類群也有一定的差異，在婺源縣溪頭鄉(xiāng)呈川村以Penicillium pulvillorum（3.08%）、Penicillium citrimum（2.64%）、Fusarium oxysporum（1.76%）為優(yōu)勢菌群，在廣豐區(qū)洋口鎮(zhèn)以Penicillium citrimum（3.96%）、Talaromyces albobiverticillius（2.20%）、Aspergillus niger（2.20%）為優(yōu)勢菌群，在鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村以Aspergillus niger（4.41%）、Penicillium pulvillorum（3.52%）、Talaromyces amestolkiae（2.20%）為優(yōu)勢菌群，在玉山縣樟村鎮(zhèn) 以Fusarium flocciferum（4.41%）、Aspergillus restrictus（2.64%）、Fusarium oxysporum（1.76%）、Bionectriasp.（1.76%）為優(yōu)勢菌群，在德興市紅山生活區(qū)以Penicillium brasilianum（1.32%）、Aspergillus flavus（0.88%）、Fusarium tricinctum（0.88%）優(yōu)勢菌群，在上饒縣田墩鎮(zhèn)以Penicillium brasilianum（2.64%）、Talaromyces verruculosus（2.64%）、Aspergillus restrictu（2.20%）為優(yōu)勢菌群，在鉛山縣石塘周邊以Aspergillus niger（2.20%）、Penicillium pulvillorum（2.20%）、Penicillium brasilianum（1.76%）、Fusarium flocciferum（1.76%）為優(yōu)勢菌群，在廣豐區(qū)小康城安利小區(qū)以Talaromyces albobiverticillius（2.20%）、Bionectriasp.（1.76%）、Talaromyces allahabadensis（1.32%）為優(yōu)勢菌群；其中Aspergillus novoparasiticus、Trematosphaeria biappendiculate為 婺 源縣溪頭鄉(xiāng)呈川村特有菌株，F(xiàn)ungalsp.為鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村特有菌株，Penicillium oxalicum、Penicillium mariae-crucis、Penicilliumsp.、Talaomyces aculeatus為玉山縣樟村鎮(zhèn)特有菌株，Aspergillus flavusvar、Fusarium tricinctum、Meyerozyma guilliermondii為德興市紅山生活區(qū)特有菌株，Talaromyces purpureogenus為上饒縣田墩鎮(zhèn)特有菌株，Penicil-lium simplicissimum、Penicillium mariae-crucis、Talaromyces allahabadensis為廣豐區(qū)小康城安利小區(qū)特有菌株，說明每個地區(qū)的環(huán)境不同導(dǎo)致了菌落的差異性。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從圖1中可以看出明顯分為三個進化分支，其自展值各為99%；其中菌株D011與Meyerozyma guilliermondiiKY108543單獨劃為一支，兩者的自展值為99%，具有較高的相似性。菌株D001、Y007、Y036聚集在一支歸屬于Fusarium，另外菌株Y042與Bionectriasp. DQ327624.1具有99%的自展值；Aspergillus、Penicillium、Talaromyces、Trematosphaeria劃為一支，均屬于散囊菌目的絲孢發(fā)菌科mitosporicTrichocomaceae；其中菌株R007、R001、Y009、Y019、1K004以及W009聚集為一支歸屬于Talaromyces，菌株1K004與Talaromyces albobiverticilliusMH869906具有99%的自展值，較高的相似性；菌株D004、Q026、D005、W041聚集為一支歸屬于Aspergillus，該四株菌種為Aspergillus的可信度較高，菌株G038與Aspergillus restrictusJF922028的自展值達到99%；菌株2Y019、K009、K006、Y014、T018等聚集為一支，歸屬于Penicillium，其中菌株G033與Penicillium citrinumMH665234的自展值為99%。

2.4 豆腐乳中真菌相似性及多樣性分析

2.4.1 上饒地區(qū)豆腐乳中真菌菌群組成的多樣性從Shannon-Wiener指數(shù)（H）來看（圖2），鉛山縣石塘周邊（H=1.92）>廣豐區(qū)小康城安利小區(qū)（H=1.57）>婺源縣溪頭鄉(xiāng)呈川村（H=1.56）>玉山縣樟村鎮(zhèn)（H=1.50）>廣豐區(qū)洋口鎮(zhèn)（H=1.42）>鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村（H=1.28）>上饒縣田墩鎮(zhèn)（H=1.26）>德興市紅山生活區(qū)（H=0.74），可以看出鉛山縣石塘周邊的豆腐乳中的真菌多樣性較高，而德興市紅山生活區(qū)的豆腐乳中的真菌多樣性是八個地區(qū)中最低的，該地區(qū)的豆腐乳中的真菌種類相當(dāng)于其他七個地區(qū)更單調(diào)。

圖 1 基于LSU基因序列構(gòu)建的豆腐乳菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of soybean curd strain based on LSU gene sequence

圖 2 不同地區(qū)豆腐乳真菌的多樣性指數(shù)Fig.2 Diversity index of fermented soybean curd fungi in different regions

2.4.2 上饒地區(qū)豆腐乳中真菌菌群組成的相似性從相似性系數(shù)來看（表3），鉛山縣石塘周邊和廣豐區(qū)小康城安利小區(qū)豆腐乳的真菌的相似性系數(shù)（Cj）為1.00，而鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村和玉山縣樟村鎮(zhèn)中豆腐乳的真菌的相似性系數(shù)（Cj）為0.29，并且Fungal只出現(xiàn)在鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村、Trematosphaeria只出現(xiàn)在婺源縣溪頭鄉(xiāng)呈川村、Meyerozyma只出現(xiàn)在德興市紅山生活區(qū)，說明鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村與玉山縣樟樹村鎮(zhèn)的豆腐乳中的真菌相似性不高，具有一定的差異性，鉛山縣石塘周邊和廣豐小康城安利小區(qū)的豆腐乳中的真菌的屬相似度很高，并且以上一些菌株只在個別地區(qū)存在，因此八個地區(qū)豆腐乳中的真菌類群存在一定的差異性和專一性。

3 結(jié)論

本研究從上饒市中八個地區(qū)豆腐乳中共分離了227個菌株，鑒定出26個分類單元：Penicillium、Aspergillus、Talaromyces、Fusarium等9個 屬26種。研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)豆腐乳中的真菌種群數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)存在較大差異性與專一性，個別地區(qū)具有特殊的菌株，如婺源縣溪頭鄉(xiāng)呈川村豆腐乳中的真菌（Aspergillus novoparasiticus、Trematosphaeria biappendiculate）為該地區(qū)的特有菌株，F(xiàn)ungalsp.為鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村豆腐乳中的特有菌株，Penicillium oxalicum、Penicillium mariae-crucis、Penicilliumsp.、Talaromyces aculeatus為玉山縣樟村鎮(zhèn)豆腐乳中的特有菌株。八個地區(qū)豆腐乳中分離得到的菌株多樣性系數(shù)和相似性系數(shù)結(jié)果表明，鉛山縣石塘周邊的豆腐乳真菌多樣性系數(shù)（H=1.92）最高，該地環(huán)境中能侵入豆腐乳的真菌相當(dāng)于其他地區(qū)種類更多；而德興市紅山生活區(qū)的豆腐乳真菌為多樣性系數(shù)（H=0.74），是八個地區(qū)中最低，該地豆腐乳中的真菌比其他七個地區(qū)種類更少；由相似性系數(shù)分析可知，鉛山縣石塘周邊和廣豐區(qū)小康城安利小區(qū)豆腐乳的真菌的相似性系數(shù)（Cj）為1.00，而鉛山縣紫溪鄉(xiāng)文山村和玉山縣樟村鎮(zhèn)中豆腐乳的真菌的相似性系數(shù)（Cj）為0.29，不同兩個地區(qū)的菌株相似性系數(shù)不相同，說明不同地區(qū)自然發(fā)酵豆腐乳的真菌具有一定的差異性。影響八個地區(qū)豆腐乳中真菌多樣性的因素很多，如溫度、濕度、季節(jié)、覆蓋的稻草環(huán)境因素等[29?30]，而有關(guān)影響豆腐乳中真菌多樣性的具體機制有待進一步探究。

表 3 不同地區(qū)豆腐乳真菌的相似性指數(shù)Table 3 Similarity index of soybean curd fungi in different regions