楊悅 劉穎 劉曉謙 楊立新 馮偉紅 李春 王智民

摘要 目的：篩選山楂核新的生物活性并闡釋其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度（MIC），評(píng)價(jià)2，2-二苯基-1-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除率及Fe3+還原能力考察山楂核乙醇提取物及其不同極性萃取部位的抗菌和抗氧化活性，得到活性部位，并通過(guò)超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析活性部位的化學(xué)成分。結(jié)果：乙酸乙酯萃取部位是山楂核抗菌、抗氧化的活性部位。經(jīng)LC-MS/MS分析從活性部位中共推測(cè)出21個(gè)化學(xué)成分，包含16個(gè)木脂素、3個(gè)苯丙素和2個(gè)黃酮類成分。結(jié)論：木脂素類成分是山楂核的主要藥效成分，值得深入研究。

關(guān)鍵詞 山楂核;抗菌;抗氧化;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;木脂素

Study on Anti-bacterial and Anti-oxidative Material Basis of Pharmacodynamics of Hawthorn Seeds Based on Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

YANG Yue，LIU Ying，LIU Xiaoqian，YANG Lixin，F(xiàn)ENG Weihong，LI Chun，WANG Zhimin

（National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Materia Medica， Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To screen new biological activities of hawthorn seeds and explain its material basis of pharmacodynamics.Methods：By measuring the minimum inhibitory concentration（MIC），the DPPH，ABTS radical scavenging rate and Fe3+ reducing ability were evaluated，and the antibacterial and antioxidant activities of the ethanol extract and different polar solvent extracts of hawthorn seeds were investigated，and the active fraction was obtained.Then，the chemical constituents of the active fraction was analyzed by Ultra performance liquid chromatography tandem time of flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF/MS）.Results：The ethyl acetate extraction part is the active fraction of hawthorn seed for anti-bacterial and anti-oxidative.A total of 21 chemical components were inferred from the active fraction by LC-MS/MS analysis，including 16 lignans，3 phenylpropanoids and 2 flavonoids.Conclusion：Lignans are the main medicinal effective ingredients of hawthorn seeds and deserve in-depth study.

Keywords Hawthorn seeds; Anti-bacterial; Anti-oxidative; Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Lignans

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.003

山楂為薔薇科植物山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）或山里紅（Crataegus Pinniatifidia Bge.var.major N.E.Br.）的干燥果實(shí)[1]。山楂核為山楂的種子，藥用歷史悠久，始載于明代《滇南本草》，其藥性平、味苦，歸肝、胃經(jīng)，具有消食、散結(jié)、催生、殺蟲、止癢的功效，常用于食積不化、疝氣、睪丸偏墜、難產(chǎn)、濕熱下注等癥[2]。許多醫(yī)藥古籍對(duì)山楂核都有記載，如《本草綱目》記載其“吞之，化食磨積，治癲疝”，并且提出其與橄欖核、荔枝核合用可治陰腎癲腫[3];《得配本草》記載其“核亦有用，化磨積食，治疝催生”[4]。作為中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用品種，人們已經(jīng)對(duì)山楂進(jìn)行了廣泛的研究[5]，而山楂核卻常被作為工業(yè)廢物而丟棄[6]。現(xiàn)代研究表明，山楂核富含木脂素、黃酮和三萜類成分，具有抗菌、抗炎、降血脂等藥理活性[7-9]。然而，目前山楂核的主要相關(guān)產(chǎn)品只有基于其干餾工藝的抑菌液，紅核婦潔洗液和薔薇紅液[10-11]，且存在味道刺鼻的缺點(diǎn)。已有研究表明，山楂核總黃酮對(duì)2，2-二苯基-1-三硝基苯肼[2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）-hydrazinyl，DPPH]和羥基自由基（Hydroxyl Radical，·OH）均有一定的清除力，并對(duì)Fe3+有較強(qiáng)的還原能力[12]，從山楂核中分離得到的一些芳香族化合物也具有較強(qiáng)的自由基清除活性[13]。為使山楂核資源變廢為寶，我們對(duì)山楂核醇提物及不同極性萃取部位的抗菌和抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，篩選得到山楂核抗菌和抗氧化活性部位，并采用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)其活性部位化學(xué)成分進(jìn)行分析，推測(cè)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為山楂核的深入開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高液相色譜儀（Waters公司，美國(guó)，型號(hào)：Acquity UPLC H-CLASS）;高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Waters公司，美國(guó)，型號(hào)：Xevo G2-S QTOF）;數(shù)據(jù)采集與處理采用Mass Lynx V4.1軟件;生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)：BSC-1000 II B2）;恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：LRH-1000L）;倒置顯微鏡（德國(guó)徠卡，型號(hào)：DMI3000）;酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：Multiskan Go1510）;可調(diào)微量移液器（Eppendorf公司，德國(guó)，貨號(hào)：3120000240）;十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，型號(hào)：XS105DU）;萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，型號(hào)：XSE104）;電子天平[上海越平科學(xué)儀器（蘇州）制造有限公司，型號(hào)：YP20002];旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司，型號(hào)：N-1300）;數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-250DB）;NEST 96孔深孔板（廣州市百菱生物科技有限公司，貨號(hào)：503501）。

1.2 材料 甲醇（批號(hào)：205308）、乙腈（批號(hào)：205302）為色譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司;甲酸（美國(guó)Tedia公司，批號(hào)：20C8562）為色譜級(jí);純凈水（屈臣氏集團(tuán)香港有限公司，批號(hào)：20210726）;三水合乙酸鈉（批號(hào)：20191127）、無(wú)水乙酸鈉（批號(hào)：20180307）、氫氧化鈉（批號(hào)：20140318）、乙酸乙酯（批號(hào)：20200914）、甲醇（批號(hào)：20201127）、冰乙酸（批號(hào)：20200616）和鹽酸（批號(hào)：20201106）等試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;紅色毛癬菌（ATCC公司，美國(guó)，貨號(hào)：MYA-4438）;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基，貨號(hào)：PDA1358）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA培養(yǎng)基，貨號(hào)：HB0253-81）購(gòu)自英國(guó)OXOID公司;RPMI-1640液體培養(yǎng)基（Thermo Fisher，美國(guó)，貨號(hào)：00883）;二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO，批號(hào)：20190218）、DPPH（批號(hào)：W27F10E81251）、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]（批號(hào)：K18N8M48402）、2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-tripyridyl triazine，TPTN）（批號(hào)：M19M7E14190）、陽(yáng)性對(duì)照VC（批號(hào)：J21S9R70775）和氟康唑（批號(hào)：HY-B0101）均購(gòu)自上海源葉生物有限公司;FeSO4·7H2O（北京化工廠，批號(hào)：20180719）;FeCl3·6H2O（北京市朝陽(yáng)通惠化工廠，批號(hào)：20190418）。

1.3 分析樣品 山楂核由山西振東制藥有限公司提供（批號(hào)：20191011），由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李春研究員鑒定為薔薇科植物山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 山楂核乙醇提取物和各萃取部位的制備 山楂核粗粉1 kg，加8倍量70%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，過(guò)濾，合并2次的濾液，回收乙醇至無(wú)醇味并濃縮至2 L，取其中500 mL收干得到浸膏，作為乙醇提取物，備用。剩余1 500 mL水液依次用同等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，減壓回收溶劑得石油醚萃取部位2.76 g，乙酸乙酯萃取部位18.24 g，正丁醇萃取部位10.32 g，以及剩余水部位5.23 g。

2.2 抗紅色毛癬菌活性研究

2.2.1 樣品工作液的制備 取2.1項(xiàng)下各部位樣品適量，精密稱定，加DMSO溶解樣品至濃度為20 mg/mL，用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋至2 mg/mL，經(jīng)0.2 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾至無(wú)菌Ep管作為樣品工作液。

2.2.2 菌接種液的制備 將受試的皮膚癬菌接種于PDA斜面上，28 ℃培養(yǎng)7～14 d。吸取2 mL無(wú)菌的0.9%的NaCl溶液，輕輕沖洗菌落表面的菌絲和孢子，吸取菌液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管中，振蕩器上振蕩15 s，將含有菌絲和孢子的沖洗液用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將其濃度調(diào)至0.5×105～1.5×105 CFU/mL之間，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋50倍，備用。

2.2.3 接種 參考改良的CLSI M38-A2方法[14]，向96孔板中第2～11列各加入100 μL RPMI-1640液體培養(yǎng)基，取200 μL樣品工作液加入第1列，取第1列孔中100 μL液體加入第2列孔中混勻，再取第2列孔中100 μL液體加入第3列孔中混勻，依序配制后續(xù)至第10列各列孔中的樣品，吸取第10列孔中液體100 μL棄掉0，第12列孔中加入200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基。96孔板的第1～11列孔中各加入紅色毛癬菌工作液100 μL。至此，第1～11列孔中紅色毛癬菌孢子濃度500～1 500 CFU/mL，樣品濃度依次為1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2、0 μg/mL。陽(yáng)性對(duì)照氟康唑的濃度依次為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/mL。第1～10列為樣品孔，第11列為正常生長(zhǎng)對(duì)照，第12列為空白對(duì)照。

2.2.4 培養(yǎng)條件和結(jié)果判定 35 ℃恒溫靜止培養(yǎng)4 d，顯微鏡下觀察各孔中是否有菌絲。與正常生長(zhǎng)對(duì)照比較，出現(xiàn)80%以上生長(zhǎng)抑制的濃度為對(duì)紅色毛癬菌的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）值。倒置顯微鏡下拍照結(jié)果見(jiàn)圖1和2（物鏡×10，目鏡×10）。山楂核各部位的MIC值見(jiàn)表1。

結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取部位是山楂核抑制紅色毛癬菌的活性部位。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 樣品溶液的制備 稱取2.1項(xiàng)下的各部位樣品約50 mg，精密稱定，加70%乙醇配制成濃度約為5 mg/mL的樣品溶液，作為儲(chǔ)備液，備用。

2.3.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參照Mukazayire等[15]的方法并略加改動(dòng)。96孔板中依次加入100 μL DPPH工作液（濃度為0.1 mg/mL，溶劑為無(wú)水乙醇）和100 μL各樣品溶液（濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.031 25、0.006 25 mg/mL，均由5 mg/mL的儲(chǔ)備液稀釋而得），37 ℃避光靜置30 min，空白組用溶劑代替DPPH工作液，對(duì)照組用溶劑代替樣品溶液，于517 nm處測(cè)定吸光度。每組樣品重復(fù)3次，求吸光度的平均值。以VC為陽(yáng)性對(duì)照（濃度分別為0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125 mg/mL），結(jié)果以清除率表示。

清除率（%）=[1-（A樣-A對(duì)）/A空]×100%

2.3.3 ABTS自由基清除能力測(cè)定 參考Ozgen等[16]的測(cè)定方法進(jìn)行。于96孔板中依次加入140 μL的ABTS工作液（濃度為2.45 mmol/L的K2S2O8儲(chǔ)備液和濃度為7.4 mmol/L的ABTS儲(chǔ)備液各5 mL，混合搖勻，黑暗中室溫靜置12～16 h，用水稀釋至吸光度為0.7±0.02，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配）和60 μL不同濃度的樣品溶液（濃度分別為1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.031 25、0.006 25 mg/mL，均由5 mg/mL的儲(chǔ)備液稀釋而得），對(duì)照組用溶劑代替樣品溶液，37 ℃下反應(yīng)6 min，于734 nm處測(cè)定吸光度，每組樣品重復(fù)3次，求吸光度的平均值。以VC為陽(yáng)性對(duì)照（濃度同DPPH試驗(yàn)），結(jié)果以清除率表示。

清除率（%）=[（A樣-A對(duì)）/A樣]×100%

以山楂核各部位不同質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基清除率作圖。見(jiàn)圖3～4。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力以IC50值大小表示。IC50值越小，表明受試物對(duì)2種自由基的清除率越好。見(jiàn)表2。

2.3.4 Fe3+還原能力測(cè)定 參考張舒婷等[17]的測(cè)定方法并略做改動(dòng)。于96孔板中精密加入30 μL70%乙醇與180 μL FRAP（Ferric Ion Reducing Antioxidant Power）工作液（分別按10∶1∶1比例量取50 mL濃度為300 mmol/L醋酸鹽緩沖液、5 mL濃度為10 mmol/L TPTZ工作液、5 mL濃度為20 mmol/L FeCl3溶液，混合搖勻，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用）混合作為空白對(duì)照;30 μL樣品溶液（濃度分別為5、2.5、0.625、0.312 5、0.156 3、0.031 25 mg/mL）與180 μL FRAP工作液混合為樣品組;37 ℃孵育反應(yīng)75 min后，于593 nm測(cè)定吸光度值A(chǔ)。以VC為陽(yáng)性對(duì)照（濃度同DPPH試驗(yàn)）。每組樣品重復(fù)3次，求吸光度的平均值。將不同濃度的FeSO4溶液代替樣品溶液，同上操作測(cè)定A，以A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=1.597 2C+0.056 0（R2=0.992 5）。以公式A=A樣-A空白計(jì)算，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算FeSO4當(dāng)量。FeSO4當(dāng)量越大，表示樣品的還原能力越強(qiáng)。以山楂核各部位質(zhì)量濃度對(duì)相應(yīng)部位求得的FeSO4當(dāng)量作圖。見(jiàn)圖5。綜合以上結(jié)果可知，乙酸乙酯萃取部位是山楂核的抗氧化活性部位。

2.4 活性部位的化學(xué)成分分析

前期試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯部位是山楂核發(fā)揮抗菌和抗氧化的活性部位，因此采用LC-MS/MS方法對(duì)乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行推測(cè)。

2.4.1 供試品溶液的制備 取2.1項(xiàng)下乙酸乙酯萃取部位樣品0.2 g，精密稱定，加2 mL色譜甲醇超聲溶解，溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.4.2 色譜-質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱：Waters UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.01%甲酸（B），梯度洗脫，洗脫程序：0～9.5 min，8% A～26% A;9.5～14 min，26% A～40% A;14～20 min，40% A～100% A;檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，柱溫30 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源（ESI）;正離子模式掃描，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓20 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣流量為50 L/h，脫溶劑氣流量700 L/h。低能量掃描傳輸碰撞能量為6 eV，高能量掃描傳輸碰撞能量為20 eV，掃描質(zhì)量范圍質(zhì)荷比（m/z）：100～1 500。

2.4.3 成分分析 山楂核乙酸乙酯部位的總離子流圖見(jiàn)圖6。運(yùn)用MassLynx V4.1對(duì)正離子模式下色譜圖進(jìn)行分析處理，分子式匹配軟件Elemental composition TM計(jì)算分子式，將各色譜峰的紫外光譜，一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜給出的離子信息與文獻(xiàn)值進(jìn)行比較，并經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)各色譜峰進(jìn)行識(shí)別。結(jié)果見(jiàn)圖6和表3。從山楂核乙酸乙酯部位共推測(cè)了21個(gè)化合物，其中16個(gè)為木脂素類，3個(gè)為苯丙素類，2個(gè)為黃酮類化合物。LC-MS分析結(jié)果顯示，山楂核活性部位中主要化學(xué)成分為木脂素，類型以氧新木脂素和苯駢呋喃型新木脂素為主。

3 結(jié)論與討論

紅色毛癬菌（Trichophyton Rubrum）是臨床最常見(jiàn)的皮膚癬菌，是淺部真菌病的主要病原菌，其中69.5%的皮膚癬菌病是由紅色毛癬菌感染所致[27]。目前臨床上皮膚癬菌耐藥現(xiàn)象較為普遍，抗真菌藥物的耐藥性問(wèn)題已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視和廣泛研究，從傳統(tǒng)中藥中尋找新型抗真菌藥物具有廣闊的市場(chǎng)前景。研究結(jié)果表明，山楂核乙酸乙酯萃取部位對(duì)紅色毛癬菌抑菌活性最好，MIC=250 μg/mL。在同一種評(píng)價(jià)體系中，不同極性萃取部位表現(xiàn)出不同的抗氧化能力，而在DPPH和ABTS自由基清除試驗(yàn)以及Fe3+還原能力試驗(yàn)3種不同的評(píng)價(jià)體系中，山楂核各萃取部位抗氧化活性趨勢(shì)基本一致，乙酸乙酯萃取部位的抗氧化活性最好。綜合分析可知，乙酸乙酯萃取部位是山楂核發(fā)揮抗紅色毛癬菌和抗氧化的活性部位。LC-MS/MS分析結(jié)果表明該部位主要含有氧新木脂素和苯駢呋喃型新木脂素類成分，而木脂素類成分具有多種良好的生物活性，如肝臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等[28-29]，因此今后應(yīng)加強(qiáng)度對(duì)乙酸乙酯部位單體成分的分離鑒定和活性評(píng)價(jià)，以為深入開(kāi)發(fā)利用山楂核資源奠定基礎(chǔ)。

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（2021-08-06收稿 責(zé)任編輯：王明）