劉志云，楊葉梅，官小鳳，黃 萍，周曉容

(1重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室，重慶 榮昌402460)

非淀粉多糖(non-starch polysaccharide，NSP)是指植物中所含的除淀粉之外的多糖類物質(zhì)，主要包括纖維素、半纖維素和果膠等，是植物性飼料的主要抗營養(yǎng)因子之一。研究表明，添加NSP酶可特異性地降解飼料中的NSP，提高飼料養(yǎng)分利用率、改善動物腸道健康、提高動物生產(chǎn)性能、降低養(yǎng)殖成本、改善養(yǎng)殖環(huán)境[1-4]。除上述作用外，采用特定NSP酶對植物源飼料原料進行適度酶解，還能夠產(chǎn)生對致病菌有抑制作用的低聚糖及其他未知產(chǎn)物，NSP酶的酶譜組成、酶解條件及飼料酶解程度決定了酶解產(chǎn)物類別及其抑菌作用的強弱。桂玲等[5]用半纖維素酶對大豆膳食纖維進行酶解，發(fā)現(xiàn)大豆膳食纖維的酶解液對大腸桿菌、假單孢菌、金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌效果。賀陽洋[6]研究發(fā)現(xiàn)，果膠經(jīng)90 min酶解，酶解率達到71%時，酶解液的抑菌活性最強，繼續(xù)酶解至120 min時抑菌效果消失，表明不同程度的酶解產(chǎn)物性質(zhì)具有很大差異性。Chimtong等[7]以糖棕櫚皮渣、蘋果皮渣、茶葉渣、咖啡渣、啤酒糟、椰子粕、稻秸等農(nóng)副資源作為酶解底物，用木聚糖酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、甘露聚糖酶和果膠酶組成的復(fù)合酶制劑制備低聚糖，所獲得的產(chǎn)物對乳桿菌具有促生長作用，對大腸桿菌具有抑制作用。用NSP酶降解飼料時，日糧組成、NSP酶活性及酶譜組成都與降解效果有很大關(guān)系[8]。玉米-豆粕型日糧是我國生豬、肉雞等養(yǎng)殖中最常見的日糧類型，由木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶組成的復(fù)合酶在玉米-豆粕型日糧中的應(yīng)用較為常見。何科林等[8]的研究表明，由木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶組成的NSP復(fù)合酶，可以提高玉米-豆粕型日糧的離體消化能。劉勝利等[9]研究表明，木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果膠酶可以顯著提高肉雞玉米-豆粕-雜粕型日糧中的還原糖釋放量和干物質(zhì)消化率。然而利用NSP酶對畜禽生產(chǎn)中的混合飼料進行適當酶解，在降低飼料中NSP含量、提高體外消化率的基礎(chǔ)上，提高飼料抑菌活性的研究較為少見。為此，本試驗以纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶為供試酶，以玉米-豆粕型飼料為底物，在探討其酶譜組成的基礎(chǔ)上，以低聚糖含量、抑菌效果以及酶解飼料的體外干物質(zhì)消化率為指標對酶解條件進行了優(yōu)化，以期為研發(fā)玉米-豆粕型酶解飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

玉米-豆粕型飼料的原料玉米、豆粕、麥麩來源于重慶市畜牧科學(xué)院科研基地，飼料組成為m(玉米)∶m(豆粕)∶m(麥麩)=67.6∶28.9∶3.5，原料粉碎后過孔徑0.85 mm篩，按照料(kg)水(L)比為1∶3的比例加水，攪拌均勻后用于酶解試驗。

纖維素酶，購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，實測酶活為8 660 U/g；木聚糖酶、果膠酶、β-葡聚糖酶，購自和氏璧生物技術(shù)有限公司，實測酶活分別為18 670， 41 330和16 670 U/g；β-甘露聚糖酶，購自卡邁舒(上海)生物科技有限公司，實測酶活為3 670 U/g。

供試菌種有大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，均由重慶市畜牧科學(xué)院養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室分離保存。

防霉劑，購自黑龍江康泰生物科技開發(fā)有限公司，主要成分為雙乙酸鈉和丙酸鈣。

1.2 玉米-豆粕型飼料的NSP酶譜篩選

采用L18(37)表進行正交試驗設(shè)計，以還原糖含量為評價指標，篩選纖維素酶(A)、木聚糖酶(B)、果膠酶(C)、β-葡聚糖酶(D)和β-甘露聚糖酶(E)降解玉米-豆粕型飼料的最佳酶譜。正交試驗因素及水平見表1。各處理組的酶解條件均為37 ℃封口靜置培養(yǎng)24 h。

表1 NSP酶譜篩選L18(37)正交試驗設(shè)計的因素與水平Table 1 Factors and levels of enzymatic pattern screening L18(37) orthogonal test for non-starch polysaccharide enzymes

1.3 酶解溫度對酶解效果的影響

將上述試驗篩選出的最佳酶譜與酶解底物充分混勻，分別在35，45，55和65 ℃酶解1 h后，取樣測定酶解樣品中的還原糖含量。每個溫度設(shè)3個重復(fù)。

1.4 酶解時間對酶解效果的影響

在最適的酶解溫度下，用篩選的NSP酶酶譜對飼料進行酶解，分別于0(CK)，3，6，9，12，15，18，21和24 h時迅速取樣，每個時間點設(shè)3個重復(fù)，冷凍干燥后測定酶解飼料樣中的可溶性糖、還原糖、低聚糖含量及體外干物質(zhì)消化率(IVDMD)。測定不同酶解時間樣品對大腸桿菌的抑制能力，確定對大腸桿菌抑菌能力最強的酶解時間，并測定該時間點酶解飼料樣品對沙門氏菌、植物乳桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制能力。

1.5 酶解飼料與添加防霉劑飼料貯存期限對比

按優(yōu)化后的酶解條件制備酶解飼料。分別取普通飼料、酶解飼料以及添加質(zhì)量分數(shù)0.05%和0.10%防霉劑的飼料各20 g放置于錐形瓶中，按料(g)水(mL)比為1∶3的比例加入蒸餾水，混合均勻，敞口放置于恒溫(25 ℃)恒濕(65%)培養(yǎng)箱中，每天記錄飼料的氣味、腐敗變質(zhì)情況，放置2 d后取樣測定其霉菌、大腸桿菌和細菌總菌落數(shù)，同時測定貯存前普通飼料的菌落數(shù)。

1.6 指標測定

1.6.1 還原糖、可溶性糖和低聚糖含量的測定 準確稱取5 g酶解飼料樣品，加入適量蒸餾水充分振蕩混合30 min，過濾收集濾液，并用蒸餾水沖洗濾渣，將濾液和濾渣沖洗液一起定容至100 mL，即得飼料酶解原液。取5 mL飼料酶解原液，用DNS比色法測定還原糖含量，用蒽酮比色法測定可溶性糖含量。低聚糖含量測定參照李燕[10]的方法并作修改：取30 mL飼料酶解原液放置于2 KD透析袋內(nèi)，于蒸餾水中低溫(4 ℃)透析48 h，中間換水3～4次，收集袋內(nèi)溶液定容至50 mL，采用蒽酮比色法測定透析袋內(nèi)溶液的糖含量，用下式計算低聚糖含量：低聚糖含量=可溶性糖平均含量-還原糖平均含量-透析袋內(nèi)糖平均含量。

1.6.2 抑菌能力的測定 按照上述方法制備飼料酶解原液100 mL，4 ℃濃縮至5 mL，備用。大腸桿菌經(jīng)斜面培養(yǎng)后，用無菌水配成細菌含量為107CFU/mL的菌懸液，備用。采用牛津杯法測定飼料酶解液對大腸桿菌的抑菌能力：吸取100 μL大腸桿菌菌懸液均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)基平板上，然后打孔，在孔中加入100 μL的飼料酶解濃縮液，將平板放入4 ℃冰箱過夜，隨后放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定飼料酶解液對供試菌種的抑菌圈直徑，以未經(jīng)酶解的飼料樣品濃縮液作為對照(CK)。取對大腸桿菌抑菌能力最強的時間點的酶解產(chǎn)物，測定其對沙門氏菌、植物乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑，測定方法同上。

1.6.3 IVDMD的測定 采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步法對酶解飼料進行離體消化，參考侯小鋒[11]的方法測定酶解飼料的IVDMD。

1.6.4 菌落計數(shù) 在超凈工作臺中稱取不同飼料樣品各1 g，與等量無菌生理鹽水充分振蕩混合，靜置20 min后，取上清進行10倍梯度稀釋。取0.1 mL稀釋液置于無菌平皿中，然后在不同平皿中分別傾注15～20 mL的營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂和孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)。待瓊脂凝固后，將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)48 h，用于細菌總數(shù)、大腸桿菌計數(shù)；將孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)5 d，用于霉菌計數(shù)。選取菌落數(shù)在25～250的適宜稀釋度的平皿進行菌落計數(shù)，根據(jù)稀釋度換算每g飼料樣品的菌落數(shù)(CFU)，結(jié)果取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用Duncan’s法進行多重比較檢驗，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米-豆粕型飼料的NSP酶譜篩選

玉米-豆粕型飼料NSP酶酶解L18(37)正交試驗結(jié)果見表2。由表2中極差(R)值可知，5種NSP酶對飼料還原糖含量的影響從大到小依次為果膠酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶。最佳酶組合為A1B3C3D3E3，即纖維素酶110 U/kg，木聚糖酶528 U/kg，果膠酶993 U/kg，β-葡聚糖酶372 U/kg，β-甘露聚糖酶249 U/kg。

表2 玉米-豆粕型飼料NSP酶酶解L18(37)正交試驗結(jié)果Table 2 The L18(37) orthogonal test result of NSP enzyme hydrolysis of corn-soybean feed

2.2 酶解溫度對飼料酶解效果的影響

NSP酶解溫度對玉米-豆粕型飼料中還原糖含量的影響如表3所示。由表3可知，溫度對飼料中NSP的酶解效果有顯著影響(P<0.05)，隨著溫度的升高，飼料中還原糖的含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當處理溫度為55 ℃時，酶解樣中還原糖含量最高(17.98 mg/g)。因此，在后續(xù)試驗中選擇55 ℃為最優(yōu)的酶解溫度。

表3 NSP酶解溫度對玉米-豆粕型飼料中還原糖含量的影響Table 3 Effect of NSP enzyme hydrolysis temperature on reducing sugar content in corn-soybean feed

2.3 酶解時間對飼料酶解效果的影響

2.3.1 不同糖組分含量 NSP酶解時間對玉米-豆粕型飼料中不同糖組分含量的影響如表4所示。由表4可知，在55 ℃下酶解9 h以內(nèi)時，飼料酶解液中的可溶性糖、還原糖和低聚糖含量均呈明顯的增加趨勢，在酶解9 h之后可溶性糖和還原糖含量仍持續(xù)增加，但低聚糖含量降低并維持在一定的區(qū)間內(nèi)。

表4 NSP酶解時間對玉米-豆粕型飼料中不同糖組分含量的影響Table 4 Effects of NSP enzyme hydrolysis time on sugar composition in corn-soybean feed mg/g

2.3.2 抑菌效果 玉米-豆粕型飼料用NSP酶解不同時間的酶解液對大腸桿菌的抑制效果如表5所示。由表5可以看出，NSP酶解0～9 h時飼料對大腸桿菌無明顯抑制作用，酶解12 h時開始產(chǎn)生抑菌效果，酶解15 h時的抑制效果最優(yōu)，之后抑菌效果開始逐漸下降。酶解15 h的飼料對沙門氏菌、植物乳桿菌、蠟樣芽胞桿菌也表現(xiàn)出了不同程度的抑制效果，抑菌圈直徑分別為33.62，38.54和42.68 mm。

表5 玉米-豆粕型飼料用NSP酶解不同時間的酶解液對大腸桿菌的抑制效果Table 5 Inhibitory effect of corn-soybean feed NSP hydrolysates at different enzymolysis times on Escherichia coli

2.3.3 酶解飼料的IVDMD 由圖1可知，隨著酶解時間的延長，飼料的IVDMD呈升高趨勢，酶解15 h時飼料的IVDMD顯著高于CK(P<0.05)，由CK的49.52%提高至54.23%；酶解18～24 h時，IVDMD進一步升高，但與酶解15 h時無顯著差異。結(jié)合2.3.1和2.3.2節(jié)結(jié)果綜合分析認為，NSP酶解的最佳時間為15 h。

柱上標不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)Different letters indicate significant differences between treatments (P<0.05)圖1 酶解時間對飼料體外干物質(zhì)消化率(IVDMD)的影響 Fig.1 Effects of enzymolysis time on in vitro dry matter digestibility (IVDMD)

2.4 酶解飼料與添加防霉劑飼料貯存期限的比較

將普通飼料、酶解飼料及添加質(zhì)量分數(shù)0.05%和0.10%防霉劑的飼料加入一定比例蒸餾水后于室溫環(huán)境中貯存，貯存起始添加防霉劑的飼料略微有丙酸的刺激性味道，酶解飼料則具有淡淡的飴糖甜味。貯存2 d后，普通飼料開始局部變黑，產(chǎn)生酸腐味，呈現(xiàn)粥糊樣(圖2-A)；酶解飼料未出現(xiàn)明顯的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，上清液澄清(圖2-B)；添加0.05%防霉劑飼料也有少量變黑并發(fā)出酸腐味，呈現(xiàn)粥糊樣(圖2-C)；添加0.10%防霉劑飼料未出現(xiàn)明顯腐敗變質(zhì)現(xiàn)象(圖2-D)。

酶解飼料和添加防霉劑飼料的菌落計數(shù)結(jié)果如表6所示，由表6可知，酶解飼料中的細菌總數(shù)和大腸桿菌數(shù)均明顯低于普通飼料和添加防霉劑飼料；酶解飼料中檢出了霉菌，且從菌絲形態(tài)初步判斷主要為青霉菌，而普通飼料和添加防霉劑飼料均未檢出霉菌。普通飼料未檢出霉菌的原因可能是:細菌生長周期短、繁殖速度快，因而能夠很快成為優(yōu)勢菌，從而暫時抑制了霉菌的生長。

A.普通飼料；B.酶解飼料；C.添加0.05%防霉劑飼料；D.添加0.10%防霉劑飼料A.Ordinary feed；B.Enzymatic hydrolyzed feed；C.Feed with 0.05% Antiseptic；D.Feed with 0.10% Antiseptic圖2 不同處理飼料在室溫下放置2 d后的表觀特征Fig.2 Apparent traits of feed in different treatments for 2 days at room temperature

表6 NSP酶酶解與防霉劑抑菌效果的比較Table 6 Comparison of antibacterial effect of enzymolysis products and antiseptic CFU/g

3 討 論

NSP是植物源飼料原料的重要組成部分，可溶性NSP會導(dǎo)致豬和家禽表現(xiàn)出明顯的抗營養(yǎng)作用，且由NSP造成的能量損失也不容小覷。飼料中添加NSP酶能特異性降解NSP，提高飼料養(yǎng)分利用率，降低NSP的抗營養(yǎng)作用。但如果酶的選擇不適宜或者酶解程度較低，則會造成生產(chǎn)成本高和資源浪費；若酶解過度，飼料中的NSP被大量降解成單糖，則有利于大腸桿菌和沙門菌等有害菌群的生長，對飼料的營養(yǎng)價值提升和保存并無裨益。因此，針對不同的飼料組成篩選適宜的NSP酶譜，同時控制酶解程度，以獲得特定功能的酶解產(chǎn)物，對于開發(fā)飼料新功能、提升飼料自身潛力有重要意義。

目前，關(guān)于NSP酶在玉米-豆粕型飼料上的離體試驗研究主要集中在提高飼料干物質(zhì)體外消化率[9,12-13]、離體消化能[8,14]、還原糖含量[9,15]以及降低消化液相對黏度[15]等方面，而往往忽視了NSP酶解中間增值產(chǎn)物的變化規(guī)律及其生物學(xué)功能。本試驗以玉米、豆粕、麥麩(質(zhì)量比為67.6∶28.9∶3.5)組成的混合飼料原料作為NSP酶的底物，篩選出了最佳的NSP酶譜，即纖維素酶110 U/kg，木聚糖酶528 U/kg，果膠酶993 U/kg，β-葡聚糖酶372 U/kg，β-甘露聚糖酶249 U/kg，酶解后的飼料還原糖含量顯著提高。在此基礎(chǔ)上又重點研究了不同酶解時間對飼料酶解產(chǎn)物中不同糖組分含量的影響，結(jié)果表明，在酶解過程中，可溶性糖和還原糖含量隨著酶解時間的增加始終呈增加趨勢，而低聚糖含量則隨酶解時間的延長呈先升高后略降低并趨于穩(wěn)定的變化規(guī)律(本研究采用的低聚糖測定方法不能嚴格代表低聚糖的真實含量，但可體現(xiàn)其變化趨勢)。酶解飼料的抑菌活性變化規(guī)律與低聚糖含量的變化基本一致，即飼料酶解12 h時開始對大腸桿菌表現(xiàn)出抑制作用，15 h時抑菌圈直徑最大，此后隨酶解的進一步進行，抑菌作用不再增強。李學(xué)紅等[16]研究表明，酶解到一定程度的果膠具有良好的抑菌活性，推測其有效抑菌成分為一些低分子量的聚半乳糖醛酸。章銀軍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，不同酶解時間獲得的柑橘果膠低聚糖的抑菌活性不同，認為只有酶解到一定程度的果膠低聚糖才能表現(xiàn)出很好的抑菌活性。王曉華[18]采用超高壓結(jié)合木聚糖酶法處理麥麩膳食纖維，得到麥麩低聚糖酶解液，通過抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，麥麩低聚糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌具有抑菌效果。據(jù)此推測，本研究中飼料酶解產(chǎn)物的抑菌作用主要與NSP酶解產(chǎn)生的低聚糖和低分子多糖有關(guān)。為了進一步驗證酶解飼料的抑菌特性，本試驗還對酶解飼料與添加防霉劑飼料的貯存效果進行了比較研究，結(jié)果表明飼料經(jīng)本方法酶解處理后細菌總數(shù)和大腸桿菌數(shù)明顯下降，抑菌效果優(yōu)于添加防霉劑組；但貯存2 d的酶解飼料中檢測出少量青霉菌，而普通飼料和防霉劑飼料均未檢出霉菌。

除了上述體外抑菌作用，飼料的NSP酶解產(chǎn)物在動物上也表現(xiàn)出對腸道致病菌的抑制作用，進而促進動物生長。Kiarie等[19-20]研究表明，豆粕、菜籽粕、小麥麩以及亞麻籽粕NSP復(fù)合酶(果膠酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶)酶解飼料上清液凍干粉，在體外可以維持產(chǎn)腸毒性大腸桿菌(ETEC)感染仔豬的體液平衡，有利于控制ETEC引起的仔豬腸道感染性腹瀉，并認為酶解產(chǎn)物中發(fā)揮此功能的物質(zhì)主要是低聚糖和低分子質(zhì)量的多糖。在后續(xù)試驗中，Kiarie等[21-22]將麥麩、豆粕、菜籽粕和亞麻籽粕(質(zhì)量比為4∶4∶1∶1)組成的混合飼料經(jīng)NSP酶解后制備酶解產(chǎn)物凍干粉，用該凍干粉飼喂21 d斷奶仔豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凍干粉可以促進仔豬采食，提高平均日增重，降低血清結(jié)合珠蛋白水平，緩解ETEC(k88)攻毒引起的仔豬急性時相反應(yīng)，降低腸道pH值，提高回腸黏膜附著乳酸菌數(shù)，改善胃腸道發(fā)酵特性和形態(tài)特征。Jia等[23]研究表明，在含亞麻籽的肉雞日糧中添加復(fù)合NSP酶制劑，可以促進產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉雞的病后代償性生長，這可能是由于添加復(fù)合NSP酶提高了亞麻籽粕中的水溶性NSP酶解產(chǎn)物含量所致。本研究結(jié)果僅為NSP酶解飼料的體外試驗效果，其在動物體內(nèi)的功效尚需進一步研究。

4 結(jié) 論

篩選出玉米-豆粕型飼料的適宜酶譜為：纖維素酶110 U/kg，木聚糖酶528 U/kg，果膠酶993 U/kg，β-葡聚糖酶372 U/kg，β-甘露聚糖酶249 U/kg。最佳酶解條件為：酶解溫度為55 ℃，酶解15 h。在此條件下制得的酶解飼料具有較高的低聚糖含量(78.65 mg/g)，對大腸桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、植物乳桿菌均有較好的抑制效果，IVDMD基本達到平穩(wěn)狀態(tài)；貯存過程中，酶解飼料的細菌抑制能力較普通飼料和加入防霉劑的飼料明顯提高。