劉文莉， 張 娟*， 堵國(guó)成， 羅 誠(chéng)， 李東亮

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；3.江南大學(xué) 協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫214122；4.四川中煙責(zé)任有限公司，四川 成都610000）

煙草中的煙梗是煙葉中相對(duì)粗硬的一部分，其質(zhì)量約占葉質(zhì)量的30%[1]。煙梗與煙葉相比，煙梗的細(xì)胞壁物質(zhì)纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等含量較高，還原糖和總糖含量較低，糖堿比失調(diào)。將煙梗切絲后應(yīng)用在卷煙中，燃吸時(shí)呈現(xiàn)出木質(zhì)氣息明顯、刺激感和灼喉感較重，以及香氣貧乏等問(wèn)題，這些問(wèn)題會(huì)嚴(yán)重影響卷煙的品質(zhì)[2]。因此，煙梗目前多作為廢棄物處理[3]，這會(huì)造成環(huán)境的大量污染和資源的浪費(fèi)。近年來(lái)，隨著煙草減害降焦工作的持續(xù)發(fā)展和對(duì)梗絲處理工藝的提升，梗絲在卷煙中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。因此，對(duì)煙梗的品質(zhì)提升和充分再利用也成為卷煙行業(yè)研究的熱點(diǎn)之一[4]。

為了降低煙梗中的細(xì)胞壁含量，目前主要通過(guò)生物法來(lái)改善煙梗品質(zhì)。陳興等選取了中性蛋白酶、半纖維素酶、果膠酶、漆酶、纖維素酶和糖化酶6種生物酶作為復(fù)合酶制劑處理煙梗、梗絲[5]。張見(jiàn)對(duì)煙梗的酶降解應(yīng)用進(jìn)行了研究與評(píng)價(jià)[6]。同時(shí)也有人通過(guò)微生物制劑來(lái)改善煙梗品質(zhì)。宋麗麗等利用白腐真菌液態(tài)發(fā)酵煙梗24 h后，煙梗中木質(zhì)素成分降解了23.11%[7]。施林燕通過(guò)對(duì)煙梗進(jìn)行黑曲霉發(fā)酵和外加酶處理，使得煙梗中纖維素、果膠和淀粉含量降低[8]。

目前已有利用微生物對(duì)煙梗發(fā)酵的研究只是針對(duì)細(xì)胞壁物質(zhì)的降解，以及產(chǎn)香微生物單獨(dú)或者菌劑復(fù)合發(fā)酵梗絲，但對(duì)于同時(shí)兼顧降解細(xì)胞壁物質(zhì)和增香的共培養(yǎng)體系發(fā)酵以改善梗絲品質(zhì)的研究很少。本研究中通過(guò)安全可靠的藥食同源真菌靈芝菌結(jié)合定向篩選獲得一株產(chǎn)香微生物膠紅酵母共培養(yǎng)后，并進(jìn)行梗絲固態(tài)發(fā)酵。靈芝菌作為藥食用白腐真菌，能夠產(chǎn)生漆酶和少部分纖維素酶、果膠酶，且本身同時(shí)合成多糖類、三萜類、腺苷類、生物堿等活性物質(zhì)，并具有特有的香味[9-10]，但單一靈芝菌固態(tài)發(fā)酵梗絲在細(xì)胞壁降解和香氣提升方面效果有限。有研究表明，類胡蘿卜素物質(zhì)可促進(jìn)白腐真菌漆酶基因的表達(dá)[11]。因此本研究中通過(guò)有目的地在煙梗上篩選出一株產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株，在對(duì)靈芝菌產(chǎn)漆酶具有誘導(dǎo)作用的同時(shí)，其所產(chǎn)生的類胡蘿卜素物質(zhì)作為煙草四大主要香氣成分之一，與煙草的香氣量和香氣品質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系[12]；該菌通過(guò)與靈芝菌共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲來(lái)改善梗絲品質(zhì)，在提高梗絲利用效率方面具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 梗絲材料煙梗、梗絲：四川中煙責(zé)任有限公司梗絲生產(chǎn)車間提供（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%～13%）。

1.1.2 菌種靈芝菌（Ganodermalucidum，G.lucidum）：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；膠紅酵母YG14（Rhodotorula mucilaginosaYG14）：分離自煙梗。

1.1.3 培養(yǎng)基PDB培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、土豆200 g/L；pH自然，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41 g/L、Vb10.1 g/L；pH自然，121℃滅菌20 min。

YEPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L；pH自然，121℃滅菌20 min。

產(chǎn)類胡蘿卜素菌株篩選培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41 g/L；pH 6.0，121℃滅菌20 min。

木質(zhì)素固體培養(yǎng)基：木質(zhì)素5 g/L、酵母粉10 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41 g/L，瓊脂20 g/L；pH自然，121℃滅菌20 min。

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）固體培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41 g/L，瓊脂20 g/L；pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 靈芝菌固態(tài)發(fā)酵梗絲靈芝菌液的制備：靈芝種子液經(jīng)過(guò)PDB培養(yǎng)基活化5 d后，用玻璃珠打散菌絲體，以5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)7 d，玻璃珠打散菌絲體得到混合均勻的靈芝菌液；

梗絲的固態(tài)發(fā)酵：將制備的靈芝菌液分別以梗絲質(zhì)量的10%、20%、30%、40%的接種量均勻噴灑至梗絲上，將梗絲裝入密封袋中，并扎少量小孔，放置在溫度30℃、濕度75%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d，將溫度升至80℃保持2 h高溫滅活。固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后將梗絲于40℃烘箱中烘至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%～13%[13]。

1.2.2 梗絲細(xì)胞壁成分測(cè)定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[14]。四川中煙責(zé)任有限公司所產(chǎn)煙梗中纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.91%，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.81%，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.9%，果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.95%。

1.2.3 產(chǎn)類胡蘿卜素菌株的篩選用無(wú)菌水在搖瓶中振蕩洗滌煙梗，獲得煙梗上的微生物，經(jīng)過(guò)平板稀釋涂布，挑選顏色為黃色、橙色或者紅色的菌株進(jìn)行分離純化和鑒定，并對(duì)篩選到的10株帶有顏色的菌株進(jìn)行產(chǎn)類胡蘿卜素能力的測(cè)定[15]。

類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法：離心收集菌體，細(xì)胞破壁后用蒸餾水洗滌2～3次，加入等體積丙酮提取類胡蘿卜素，離心后取上清液即為類胡蘿卜素提取液，475 nm下測(cè)定吸光度。

式（1）中：I為類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（以干菌體質(zhì)量計(jì)），μg/g；Aλmax為最大吸收波長(zhǎng)475 nm下的吸光度；V為提取所用有機(jī)溶劑的總體積，mL；D為浸提液稀釋倍數(shù)；W為菌的干質(zhì)量，g；0.16，類胡蘿卜素的消光系數(shù)。

對(duì)初篩得到的10株菌分別在木質(zhì)素作為唯一碳源的固體培養(yǎng)基和CMC-Na作為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃板培養(yǎng)，放到30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d后觀察菌株是否生長(zhǎng)。

1.2.4 靈芝菌、膠紅酵母YG14單菌和共培養(yǎng)混菌發(fā)酵液漆酶測(cè)定（ABTS法）

按照方法1.2.1獲得靈芝菌液、按照方法1.2獲得膠紅酵母、共培養(yǎng)混菌菌液。

酶活測(cè)定方法：3 mL反應(yīng)體系里含有0.5 mL 1 mmol/L ABTS溶液、2 mL 0.05 mol/L pH 3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和0.5 mL粗酶液（發(fā)酵菌液8 000 r/min離心5 min取上清液），在45℃下反應(yīng)5 min，沸水浴10 min終止反應(yīng)，測(cè)定OD420nm。

式（2）中：k為漆酶酶活，U/L；V總為漆酶酶活測(cè)定反應(yīng)體系總體積，mL；V酶為添加酶液體積，mL；△t為反應(yīng)時(shí)間，min；ε為3.6×104，L/（mol·cm）[16]。

1.2.5 膠紅酵母YG14、靈芝菌和膠紅酵母YG14共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲

1）膠紅酵母菌液的制備 膠紅酵母YG14經(jīng)過(guò)YEPD液體培養(yǎng)基活化2 d后，以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)2 d后得到膠紅酵母YG14菌液。

2）靈芝菌與膠紅酵母共培養(yǎng)菌液的制備 靈芝種子液經(jīng)過(guò)PDB培養(yǎng)基活化5 d后，用玻璃珠打散菌絲體，以5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)2 d，隨后將搖瓶培養(yǎng)2 d的膠紅酵母YG14菌以5%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至靈芝菌發(fā)酵搖瓶?jī)?nèi)，共同培養(yǎng)4 d，得到共培養(yǎng)菌液，其中膠紅酵母活菌數(shù)約7×108CFU/mL，靈芝菌體干質(zhì)量濃度約11 g/L。

3）梗絲的固態(tài)發(fā)酵 膠紅酵母YG14固態(tài)發(fā)酵梗絲：將1）中制備的膠紅酵母YG14菌液分別以梗絲質(zhì)量的10%、20%、30%、40%的接種量均勻噴灑至梗絲上，將梗絲裝入密封袋中，并扎少量小孔，放置在溫度30℃、濕度75%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d，將溫度升至80℃保持2 h高溫滅活。固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后將梗絲于40℃烘箱中烘至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%～13%。

共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲：將2）中制備的共培養(yǎng)菌液以梗絲質(zhì)量的5%、10%、20%、30%的接種量均勻噴灑至梗絲上，將梗絲裝入密封袋中，并扎少量小孔，放置在溫度30℃、濕度75%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d，將溫度升至80℃保持2 h高溫滅活。固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后將梗絲于40℃烘箱中烘至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%～13%。

1.2.6 梗絲揮發(fā)性香氣成分測(cè)定

1）樣品前處理 靈芝菌、膠紅酵母YG14單菌和共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵后的梗絲在40℃烘箱中干燥，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱取1 g樣品于頂空瓶?jī)?nèi)用頂空微萃取法進(jìn)行萃取后進(jìn)行GCMS分析，對(duì)照組為噴灑高溫滅活的發(fā)酵液梗絲[17-33]。

2）GC-MS聯(lián)用儀分析條件 頂空萃取頭：DVB/CAR/PDMS（50/30μm）；色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：260℃；載氣：Methane，1 mL/min；程序升溫：55℃保持1 min，5℃/min升至80℃，3℃/min升至200℃，5℃/min升至260℃保持5 min；進(jìn)樣量：2μL；分流比：20∶1；傳輸線溫度：280℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：300℃；四級(jí)桿溫度：160℃；質(zhì)量范圍（m/z）：33～600。結(jié)果分析采用NIST05、Wiley275普庫(kù)進(jìn)行檢索定性[28]。

1.2.7 梗絲感官品吸評(píng)價(jià)將空白處理梗絲，靈芝菌、膠紅酵母YG14單菌和共培養(yǎng)混菌發(fā)酵的梗絲制成手工卷制的煙支，在（22±1）℃、（60±1）%相對(duì)濕度下平衡48 h，然后組織四川中煙責(zé)任有限公司相關(guān)評(píng)吸專家進(jìn)行梗絲的品吸評(píng)價(jià)[29]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌固態(tài)發(fā)酵梗絲結(jié)果

梗絲經(jīng)過(guò)靈芝菌固態(tài)發(fā)酵6 d后，烘干并測(cè)定細(xì)胞壁纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，通過(guò)計(jì)算得到細(xì)胞壁物質(zhì)降解結(jié)果（見(jiàn)表1）。靈芝菌固態(tài)發(fā)酵梗絲，總細(xì)胞壁降解程度隨著靈芝菌接種量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在接種量為梗絲質(zhì)量的20%時(shí)總細(xì)胞壁物質(zhì)降解程度達(dá)到最高，降解率為16.40%，其中纖維素降解率為14.74%、木質(zhì)素降解率為24.40%、半纖維素降解率為15.82%、果膠降解率為15.13%，靈芝菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)梗絲的木質(zhì)素降解效果較好，但是對(duì)其他物質(zhì)的降解效果一般，使得梗絲總細(xì)胞壁物質(zhì)的降解率較低。

表1 靈芝菌固態(tài)發(fā)酵梗絲細(xì)胞壁物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 1 Cell wall substance measurement results of G.lucidum solid fermentation stem silk

將靈芝菌發(fā)酵的梗絲進(jìn)行品吸，結(jié)果見(jiàn)表2。靈芝菌接種量為梗絲質(zhì)量的20%時(shí)品吸效果最好，其甜感提升明顯，木質(zhì)氣息有所減輕，灼燒感較輕微，刺激感較輕微。靈芝菌固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)靈芝多糖和漆酶，因此對(duì)梗絲的甜感和木質(zhì)氣息改善較明顯，但是對(duì)纖維素和果膠的降解效果不顯著，因此在灼燒感和刺激感方面改善較不明顯。而香氣感在接種量加大后才有顯著提升，猜測(cè)主要是加入的大量菌液中帶入一些靈芝菌發(fā)酵液中的成香物質(zhì)，但是接種量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致因菌體過(guò)多在燃吸時(shí)產(chǎn)生異味。

表2 靈芝菌固態(tài)發(fā)酵梗絲感官品吸評(píng)價(jià)Table 2 Sensory evaluation of G.lucidum solid fermentation stem silk

通過(guò)細(xì)胞壁物質(zhì)降解和品吸評(píng)價(jià)，靈芝菌固態(tài)發(fā)酵梗絲最佳接種量為梗絲質(zhì)量的20%，但是靈芝菌對(duì)于梗絲品質(zhì)的提升效果有限，因此選擇從煙梗上篩選一株菌進(jìn)行復(fù)合固態(tài)發(fā)酵梗絲，來(lái)增強(qiáng)梗絲的降解效果和香氣量的提升。通過(guò)查找文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素能夠促進(jìn)白腐真菌漆酶的表達(dá)，另外類胡蘿卜素物質(zhì)也是煙葉中四大主要香氣成分之一。因此選擇篩選一株能夠產(chǎn)類胡蘿卜素物質(zhì)，并且可同時(shí)降解纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)的菌株與靈芝菌共培養(yǎng)復(fù)合處理梗絲。

2.2 產(chǎn)類胡蘿卜素菌的篩選

類胡蘿卜素一般呈現(xiàn)紅色至黃色，對(duì)煙梗上分離的45株菌進(jìn)行產(chǎn)類胡蘿卜素菌的篩選，初篩得到帶有類胡蘿卜素顏色特征的菌株共10株（見(jiàn)圖1），通過(guò)序列分析比對(duì)和鑒定分別為Rhodosporidiobolus、Rhodotorula mucilaginosa、Methylorubrum、Planococcus、Mixta intestinalis、Sphingomonas、Franconibacter、Stenotrophomonas、Ochrobactrum、Microbacterium。分別命名為RhodosporidiobolusYG1、Rhodotorula mucilaginosaYG14、MethylorubrumYG17、PlanococcusYG19、Mixta intestinalisYG20、SphingomonasYG21、FranconibacterYG22、StenotrophomonasYG24、OchrobactrumYG25、MicrobacteriumYG27。對(duì)這10株菌進(jìn)行產(chǎn)類胡蘿卜素能力測(cè)定，結(jié)果如表3所示，產(chǎn)類胡蘿卜素的共有5株菌，其產(chǎn)類胡蘿卜素能力由大到小依次為：Rhodotorula mucilaginosaYG14、RhodosporidiobolusYG1、SphingomonasYG21、PlanococcusYG19、MethylorubrumYG17。

表3 煙梗上篩選的10株菌測(cè)定結(jié)果Table 3 Measurement results of 10 strains selected on tobacco stems

圖1 煙梗上產(chǎn)類胡蘿卜素菌的初篩Fig.1 Primary screening of carotenoid producing bacteria on tobacco stems

本次篩選一株產(chǎn)類胡蘿卜素菌的目的是與靈芝菌共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲，因此在高產(chǎn)類胡蘿卜素的基礎(chǔ)上還能夠降解細(xì)胞壁物質(zhì)，因此考察了這10株菌對(duì)木質(zhì)素和CMC-Na的利用情況，能夠利用木質(zhì)素的有4個(gè)菌株，菌號(hào)分別為YG1、YG14、YG17、YG19；能夠利用CMC-Na的有3個(gè)菌株，菌號(hào)分別為YG1、YG14、YG20。

菌號(hào)YG14和YG1兩株菌不僅產(chǎn)類胡蘿卜素，同時(shí)可利用木質(zhì)素和CMC-Na，而且YG14的類胡蘿卜素產(chǎn)量最高。因此，選擇煙梗上篩選到的一株膠紅酵母YG14作為靈芝菌的共培養(yǎng)菌進(jìn)行梗絲的混菌固態(tài)發(fā)酵。

2.3 膠紅酵母YG14固態(tài)發(fā)酵梗絲

將膠紅酵母YG14固態(tài)發(fā)酵處理梗絲6 d后，烘干并測(cè)定細(xì)胞壁纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，通過(guò)計(jì)算得到細(xì)胞壁物質(zhì)降解結(jié)果（見(jiàn)表4），膠紅酵母YG14固態(tài)發(fā)酵梗絲總細(xì)胞壁降解程度隨著接種量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在接種量為梗絲質(zhì)量的20%時(shí)總細(xì)胞壁物質(zhì)降解程度達(dá)到最高，降解率為24.91%。其中纖維素降解率為32.83%、木質(zhì)素降解率為12.03%、半纖維素降解率為33.54%、果膠降解率為11.76%，膠紅酵母YG14對(duì)纖維素和半纖維素的降解效果較好。

表4 膠紅酵母YG14固態(tài)發(fā)酵梗絲細(xì)胞壁物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination of cell wall material in solid fermented stem of R.mucilaginosa YG14

膠紅酵母YG14固態(tài)發(fā)酵梗絲在以梗絲質(zhì)量20%的接種量時(shí)梗絲品吸效果最好（見(jiàn)表5），與靈芝菌固態(tài)發(fā)酵梗絲相比，香氣量提升的比較明顯，但是燒紙氣息和木質(zhì)氣息改善較不明顯，猜測(cè)主要是因?yàn)槟z紅酵母YG14對(duì)梗絲木質(zhì)素和果膠的降解效果不明顯。

表5 膠紅酵母YG14固態(tài)發(fā)酵梗絲感官品吸評(píng)價(jià)Table 5 Sensory evaluation of R.mucilaginosa YG14 solid fermentation stem silk

2.4 靈芝菌、膠紅酵母YG14單菌和共培養(yǎng)混菌發(fā)酵液的漆酶測(cè)定結(jié)果

膠紅酵母YG14單菌液態(tài)發(fā)酵2 d后取上清液測(cè)定漆酶酶活，經(jīng)過(guò)測(cè)定可知膠紅酵母YG14可產(chǎn)生少部分的漆酶，酶活為14.28 U/L。將靈芝菌液、靈芝菌與膠紅酵母YG14共培養(yǎng)混合菌液離心后分別取上清液測(cè)定漆酶酶活，結(jié)果如圖2所示。靈芝單菌發(fā)酵液在第7天時(shí)漆酶酶活達(dá)到最大，為499.87 U/L；靈芝菌與膠紅酵母YG14共培養(yǎng)發(fā)酵液在第6天時(shí)漆酶酶活達(dá)到最大，為1 129.17 U/L，比靈芝單菌最高酶活（第7天）提高了1.25倍。靈芝菌與膠紅酵母YG14共培養(yǎng)液態(tài)發(fā)酵，膠紅酵母YG14能夠促進(jìn)靈芝菌漆酶的表達(dá)，共培養(yǎng)菌液中不僅含有膠紅酵母YG14和靈芝菌兩種菌，還含有大量漆酶、少量纖維素酶和果膠酶，比靈芝單菌液態(tài)發(fā)酵的酶系更全面協(xié)調(diào)，而且漆酶酶活提高，發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間縮短。

圖2 漆酶酶活測(cè)定Fig.2 Laccase activity assay

2.5 共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲

靈芝菌和膠紅酵母YG14液態(tài)共培養(yǎng)后混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲6 d，烘干并測(cè)定細(xì)胞壁纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，通過(guò)計(jì)算得到細(xì)胞壁物質(zhì)降解結(jié)果（見(jiàn)表6）。在共培養(yǎng)菌液接種量為梗絲質(zhì)量的10%時(shí)梗絲總細(xì)胞壁物質(zhì)降解效果最好，降解率為37.20%，其中纖維素降解率為38.81%、木質(zhì)素降解率為33.26%、半纖維素降解率為28.23%、果膠降解率為41.43%，靈芝菌與膠紅酵母YG14共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲后細(xì)胞壁各物質(zhì)降解相對(duì)比較協(xié)調(diào)，且降解效果明顯，比單菌效果更好。

表6 共培養(yǎng)固態(tài)發(fā)酵梗絲細(xì)胞壁物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 6 Co-cultured solid fermented stem silk cell wall substance assay results

靈芝菌和膠紅酵母YG14共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲后梗絲品吸結(jié)果見(jiàn)表7，共培養(yǎng)菌液接種量為梗絲質(zhì)量的10%時(shí)，梗絲品吸效果最好，甜感提升明顯，木質(zhì)氣息改善明顯，香氣量有一定提升，灼燒刺激感改善明顯，并且香氣更顯圓潤(rùn)。共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲，在較少的接種量情況下降解效率提升明顯，梗絲品質(zhì)改善明顯。

表7 共培養(yǎng)固態(tài)發(fā)酵梗絲感官品吸評(píng)價(jià)Table 7 Sensory evaluation of co-cultured solid fermented stems

2.6 梗絲固態(tài)發(fā)酵前后致香成分變化

通過(guò)GC-MS對(duì)不同處理?xiàng)l件下的梗絲進(jìn)行致香成分含量變化檢測(cè)，共檢測(cè)到200多種成分，其中共檢測(cè)到58種致香成分。對(duì)梗絲中性致香成分主要進(jìn)行以下6種分類：苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、棕色化反應(yīng)產(chǎn)物、類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、西柏烷類轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、新植二烯和其他物質(zhì)。

選擇靈芝菌、膠紅酵母YG14單菌和共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲細(xì)胞壁降解效果和感官品吸效果最好的3個(gè)條件下處理的梗絲與對(duì)照組梗絲進(jìn)行中性致香物質(zhì)的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。靈芝單菌固態(tài)發(fā)酵梗絲在以梗絲質(zhì)量20%的接種量時(shí)總揮發(fā)性成分提升11.45%；膠紅酵母YG14單菌固態(tài)發(fā)酵梗絲在以梗絲質(zhì)量20%的接種量時(shí)梗絲總揮發(fā)性成分提升12.79%；靈芝菌和膠紅酵母YG14共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲在以梗絲質(zhì)量10%的接種量時(shí)總揮發(fā)性成分提升20.44%。共培養(yǎng)菌液在以梗絲質(zhì)量10%的接種量發(fā)酵梗絲時(shí)，中性致香成分變化顯著的物質(zhì)為棕色化反應(yīng)產(chǎn)物和新植二烯，其中棕色化反應(yīng)產(chǎn)物主要起到改善梗絲氣味，增加梗絲的香氣、甜味，降低雜氣和刺激性的作用；新植二烯會(huì)降低煙氣中的刺激性和雜氣產(chǎn)生，平衡煙氣，使其更圓潤(rùn)。根據(jù)總揮發(fā)性致香成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化可以得出靈芝菌和膠紅酵母YG14共培養(yǎng)混菌比靈芝單菌、膠紅酵母YG14單菌固態(tài)發(fā)酵梗絲效果明顯更好。

表8 梗絲處理前后中性致香物質(zhì)的變化Table 8 Changes of neutral aroma components before and after tobacco stem treatment

2.7 梗絲綜合感官品吸評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)梗絲細(xì)胞壁成分測(cè)定和3組品吸結(jié)果分析，選擇靈芝單菌接種量為梗絲質(zhì)量的20%、膠紅酵母YG14單菌接種量為梗絲質(zhì)量的20%和共培養(yǎng)混菌接種量為梗絲質(zhì)量的10%3組固態(tài)發(fā)酵后的梗絲與對(duì)照組梗絲制成手工卷制的煙支，感官品吸結(jié)果（見(jiàn)表9）表明：經(jīng)過(guò)微生物菌液固態(tài)發(fā)酵后的梗絲甜感提升，木質(zhì)氣息改善，香氣量也有一定的提升，灼燒感和刺激感減弱。經(jīng)過(guò)排序結(jié)果表明接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的靈芝菌和膠紅酵母YG14共培養(yǎng)混菌固態(tài)發(fā)酵后的梗絲品吸效果最佳。

表9 梗絲感官品吸評(píng)價(jià)Table 9 Tobacco stem sensation evaluation

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究中從煙梗上篩選到一株輔助靈芝菌降解細(xì)胞壁物質(zhì)并且有提質(zhì)增香作用的膠紅酵母菌。將兩株菌進(jìn)行液態(tài)共培養(yǎng)后混菌固態(tài)發(fā)酵梗絲，發(fā)酵結(jié)束后梗絲總細(xì)胞壁物質(zhì)降解達(dá)到37.20%；中性致香成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升20.44%；感官品吸評(píng)價(jià)為甜感提升明顯，木質(zhì)氣息改善明顯，香氣量有一定提升，灼燒刺激感改善明顯，香氣更顯圓潤(rùn)。綜上所述，篩選獲得的膠紅酵母YG14與靈芝菌液態(tài)共培養(yǎng)后固態(tài)發(fā)酵梗絲細(xì)胞壁物質(zhì)降解效果明顯，感官品質(zhì)改善明顯，具有較好的應(yīng)用前景。本研究可以為工業(yè)化應(yīng)用奠定一定的技術(shù)基礎(chǔ)。