程夢(mèng)雨,李小強(qiáng),王鵬,張華,張紹鈴,吳巨友,3*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095;2.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院,上海 201699;3.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014)

多肽激素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫反應(yīng)均具有重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region)是最大的植物多肽激素家族之一,其參與植物細(xì)胞間交流,特別是在莖尖分生組織、根頂端分生組織和維管形成層中參與維持細(xì)胞增殖與分化的平衡[3]。CLE多肽家族結(jié)構(gòu)特征鮮明,其N端為信號(hào)肽,中間為可變域,C端為保守結(jié)構(gòu)域,其中,保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸長(zhǎng)度為12～14,稱為CLE基序或CLE結(jié)構(gòu)域[4]。除了典型的三重域外,有些CLE基因還包括1個(gè)稱為C端延伸的第4域,但該結(jié)構(gòu)域并不是高度保守[5]。

迄今為止,已在擬南芥[6]、楊樹[7]、番茄[8]、葡萄[9]、小麥[10]、大豆[11]和棉花[12]等多個(gè)物種中鑒定并分析了CLE多肽家族。擬南芥有32個(gè)CLE基因,根據(jù)功能分為4類。Group-A可抑制頂端分生組織的發(fā)育和木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞的分化;Group-B可以抑制分生組織活性;Group-C成員可促進(jìn)木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞的分化;Group-D的作用尚不清楚[13]。除了植物之外,在囊線蟲中也發(fā)現(xiàn)了CLE基因[14],其可以利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生有功能的CLE多肽,進(jìn)一步促進(jìn)線蟲感染宿主植物[15-16]。

薔薇科果樹包括梨、蘋果、桃等,在果樹中占有極重要的地位,但薔薇科果樹中關(guān)于CLE多肽家族的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。隨著基因組測(cè)序的完成,在梨等薔薇科果樹中研究基因家族信息成為可能,因此本研究基于6個(gè)薔薇科物種的全基因組數(shù)據(jù)共鑒定出91個(gè)CLE基因,通過生物信息學(xué)方法探討其基本特性和進(jìn)化特征,并通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及熒光定量分析研究梨CLE基因在各組織以及花柱和花粉不同發(fā)育階段的表達(dá)情況;同時(shí)合成梨PbrCLE31多肽,檢測(cè)其對(duì)花粉管生長(zhǎng)的調(diào)控作用,旨在為闡明PbrCLE31的功能及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為梨全基因組測(cè)序品種‘碭山酥梨’,種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地。開花前2 d采集梨花粉,室溫自然散粉后放入硫酸紙袋-20 ℃干燥保存;花柱保存于-80 ℃冰箱。

1.2 薔薇科CLE家族的篩選和鑒定

從TAIR10(http://www.arabidopsis. org)中下載擬南芥32個(gè)CLE多肽序列。利用AtCLE的多肽序列對(duì)6個(gè)薔薇科物種蛋白序列進(jìn)行BLASTp搜索,并根據(jù)32個(gè)AtCLE的多肽序列,建立隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model,HMM);使用HMMER 3軟件[17]對(duì)薔薇科果樹的蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行HMM搜索。從梨數(shù)據(jù)庫(http://peargenome.njau.edu.cn)下載梨(Pyrusbretschneideri)的基因組序列。蘋果(Malusdomestica)、桃(Prunuspersica)、草莓(Fragariavesca)和黑樹莓(Rubusoccidentalis)的基因組序列信息從薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.Rosaceae.org)中下載。梅(Prunusmume)基因組序列從梅基因組數(shù)據(jù)庫(http://prunusmumegenome. bjfu.edu.cn/index.jsp)獲取。檢索到的所有候選基因的序列均用作迭代查詢,去除沒有CLE基序的候選基因,最終確定CLE基因。

1.3 薔薇科CLE家族生物信息學(xué)分析

通過在線預(yù)測(cè)工具Sequence Manipulation Suite(https://www. genscript. com/sms2/index. html)預(yù)測(cè)6個(gè)薔薇科物種CLE的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn),輸入多肽序列,并保留默認(rèn)參數(shù)提交。使用MEGA X[18]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,用Clustal W程序比對(duì)6個(gè)薔薇科物種和擬南芥的所有CLE全長(zhǎng)多肽序列,使用最大似然法(maximum likelihood,ML)構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹,bootstrap 值設(shè)置為1 000。從每個(gè)物種的基因組注釋文件中獲得CLE多肽家族成員的染色體位置信息和相關(guān)基因?qū)π畔?然后使用TBtools軟件[19]繪制CLE基因在染色體上的位置和共線性對(duì),不包括位于scaffolds的基因。利用MEME[20]對(duì)CLE基因的保守基序進(jìn)行分析,參數(shù)中基序的最大值設(shè)置為5,基序長(zhǎng)度設(shè)置為6～50。利用GSDS 2.0[21]分析CLE基因的結(jié)構(gòu)。采用PGDD[22]分析CLE基因重復(fù)事件,采用MCScanX[23]識(shí)別不同的重復(fù)事件。使用TBtools軟件通過鄰接(NG)法來計(jì)算同源基因?qū)Φ姆峭x替代率(Ka)和同義替代率(Ks),根據(jù)Ks值計(jì)算進(jìn)化時(shí)間(T=Ks/2k,k值為1.5×10-9)[24];根據(jù)Ka/Ks值確定其在演化過程中的選擇方式,當(dāng)Ka/Ks>1時(shí)為陽性選擇,Ka/Ks=1時(shí)為中性選擇,Ka/Ks<1時(shí)為純化選擇[25]。

1.4 梨PbrCLE基因的表達(dá)模式分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下載?！X山酥梨’不同組織(莖、葉、子房、果實(shí)、芽、花瓣、萼片)、不同花柱(未授粉花柱、異交授粉花柱和自交授粉花柱)以及不同花粉發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均來自文獻(xiàn)[26-28]。將基因表達(dá)量數(shù)據(jù)通過log2歸一化后使用TBtools軟件將表達(dá)結(jié)果可視化。

1.5 多肽合成及處理花粉管

合成的梨CLE多肽購于杭州丹港生物科技有限公司,合成的多肽序列如下:PbrCLE3,KRQVPTGPNPLHS;PbrCLE7,KRQVLRGPDSKHG;PbrCLE12,KRKVGRGSDPIHN;PbrCLE24,DRRVPGGPDSQHH;PbrCLE31,AHEVPSGPNPISN,其純度分別為96.82%、96.93%、96.83%、96.90%和96.85%。將合成的多肽稀釋至10 mmol·L-1作為母液,在198 μL花粉培養(yǎng)基中加入2 μL多肽母液,使花粉培養(yǎng)基中CLE多肽質(zhì)量濃度為100 μmol·L-1,以不含多肽的花粉培養(yǎng)基處理花粉作為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次。同時(shí),分別用1 和100 μmol·L-1PbrCLE31處理花粉。花粉培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[2]?；ǚ酃芘囵B(yǎng)3 h后用顯微鏡拍照并記錄,使用Image-Pro Plus6.0(http://www. mediacy.com)軟件測(cè)量花粉管的長(zhǎng)度。

1.6 CLE基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

使用RT-qPCR方法檢測(cè)樣品中CLE基因的相對(duì)表達(dá)量。采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)提取RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 RevertAid 1st cDNA Synth Kit(Thermo Fisher Scientific,Massachusetts,USA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成的cDNA用于RT-qPCR分析。使用NCBI引物設(shè)計(jì)工具Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih gov/tools/primer-blast)設(shè)計(jì)基因特異性引物(表1),并在梨基因組中進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。反應(yīng)體系(10 μL):0.2 μL cDNA模板,2.5 μL正、反引物預(yù)混液(0.05 μmol·L-1),5 μL 2×SYBR Green Master Mix(Roche)和2.3 μL ddH2O。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 3 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 30 s,共55個(gè)循環(huán)。梨的內(nèi)參基因使用PbrUBQ。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量,采用Excel 2016進(jìn)行圖表繪制和統(tǒng)計(jì)分析。

表1 用于RT-qPCR分析的引物序列Table 1 Oligonucleotide sequences for primers used in RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 薔薇科果樹中CLE基因的鑒定和分類

使用已報(bào)道的擬南芥32個(gè)CLE多肽序列作為參照,篩選出薔薇科6個(gè)物種的CLE候選基因。同時(shí)使用MEME(http://meme-suite.org)從薔薇科候選CLE中識(shí)別出保守的CLE基序。參考葡萄CLE基因成員的篩選條件,根據(jù)候選CLE基因的CLE基序(E值<10-7),確定6個(gè)薔薇科物種的CLE基因,共鑒定出91個(gè)CLE基因(表2)。根據(jù)基因ID的順序,將已鑒定的基因分別命名為:PbrCLE1—PbrCLE35、PmCLE1—PmCLE8、PpCLE1—PpCLE17、RoCLE1—RoCLE16、FvCLE1—FvCLE7和MdCLE1—MdCLE8(表2)。通過對(duì)梨CLE多肽家族的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),該家族編碼的多肽長(zhǎng)度為 54～348個(gè)氨基酸,最大和最小蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分別為5.72×103和38.31×103;PbrCLE5的等電點(diǎn)最小(4.60),PbrCLE11的等電點(diǎn)最大(12.51),PbrCLE等電點(diǎn)的平均值為9.85,表明該家族多肽偏堿性。

2.2 薔薇科果樹中系統(tǒng)進(jìn)化和保守基序分析

使用MEGA X軟件,對(duì)檢索到的6個(gè)薔薇科物種和擬南芥CLE多肽序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。參考擬南芥[13]中CLE基因的分類,將其分為4組:Group-A、Group-B、Group-C和Group-D。Group-A含有薔薇科果樹CLE基因最多(34個(gè)),其次是Group-B(23個(gè))和Group-C(22個(gè)),而Group-D成員最少(12個(gè))(表2)。

表2 6個(gè)薔薇科物種中CLE基因的基本信息Table 2 Basic information of CLE gene of six species of Rosaceae

圖1 薔薇科果樹和擬南芥CLE多肽序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of CLE peptide sequence in fruit trees of Rosaceae and Arabidopsis 進(jìn)化樹中五角星、三角形和正方形分別對(duì)應(yīng)擬南芥、梨和其他薔薇科物種(蘋果、梅、草莓、黑樹莓和桃)的CLE成員。紅色、綠色、藍(lán)色和橙色分別代表4個(gè)亞組:Group-A、Group-B、Group-C和Group-D。The pentagram,triangle and square of the evolutionary tree correspond to CLE members of Arabidopsis,Pyrus bretschneideri,and other Rosaceae species(Malus domestica,Prunus mume,Fragaria vesca,Rubus occidentalis and Prunus persica),respectively. Red,green,blue,and orange represent four different subgroups:Group-A,Group-B,Group-C and Group-D,respectively.

2.3 薔薇科果樹中CLE基因的染色體位置和共線性分析

由圖2和表2可見:梨的35個(gè)CLE基因分布于12條不同的染色體上,因染色體組裝不完善,另有3個(gè)基因(PbrCLE3、PbrCLE8和PbrCLE9)未能定位到染色體上;草莓的7個(gè)CLE基因位于5條不同的染色體上;蘋果的8個(gè)CLE基因位于6條不同的染色體上;梅的8個(gè)CLE基因位于5條不同的染色體上,還有1個(gè)基因(PmCLE8)未能定位到染色體上;桃的17個(gè)基因位于6條不同的染色體上;黑樹莓的16個(gè)CLE基因位于6條不同的染色體上。另外,對(duì)6個(gè)薔薇科果樹進(jìn)行基因組內(nèi)共線性分析,共發(fā)現(xiàn)19對(duì)共線基因,其中梨9對(duì),蘋果6對(duì),桃4對(duì),而草莓、梅和黑樹莓中未發(fā)現(xiàn)共線基因?qū)?圖2)。

圖2 CLE基因在薔薇科果樹中的染色體定位和共線性分析Fig.2 Chromosomal localization and collinearity analysis of the CLE genes in Rosaceae fruit trees 具有共線關(guān)系的基因?qū)τ杉t線連接,灰色背景代表所有共線性對(duì)。Gene pairs with a collinear relationship were connected by a red line,and the gray background represents all the collinearity pairs.

2.4 梨基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

由圖3可見:從35個(gè)PbrCLE的基因結(jié)構(gòu)中,可以發(fā)現(xiàn)大部分PbrCLE基因缺少內(nèi)含子。僅6個(gè)PbrCLE基因具有內(nèi)含子,其中4個(gè)PbrCLE基因有1個(gè)內(nèi)含子,2個(gè)PbrCLE基因有2個(gè)內(nèi)含子。通過MEME在線軟件分析梨的35個(gè)CLE多肽的序列特征,發(fā)現(xiàn)有5個(gè)保守基序,35個(gè)成員的motif 1中均含有CLE結(jié)構(gòu)域的基序,3個(gè)成員含有motif 2,8個(gè)成員含有motif 3,2個(gè)成員含有motif 4,3個(gè)成員含有motif 5。通過比較35個(gè)PbrCLE基因的CLE結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)其高度保守。同時(shí),許多位于不同染色體上的PbrCLE基因含有相同或幾乎相同的CLE基序,例如:PbrCLE1、PbrCLE2和PbrCLE22含有相同的CLE結(jié)構(gòu)域;PbrCLE8、PbrCLE9和PbrCLE35含有相同的CLE結(jié)構(gòu)域;PbrCLE4、PbrCLE13和PbrCLE31含有相同的CLE結(jié)構(gòu)域。另外還有含有相同CLE結(jié)構(gòu)域的基因?qū)?如PbrCLE16/PbrCLE21、PbrCLE27/PbrCLE34,表明這些基因可能存在相似的功能。

2.5 CLE多肽家族重復(fù)事件分析和Ka/Ks分析

由表3可見:在PGDD數(shù)據(jù)庫中共獲得梨的同源基因?qū)?2對(duì),其中10對(duì)為片段復(fù)制,2對(duì)為間隔復(fù)制,2對(duì)為串聯(lián)復(fù)制,2對(duì)為轉(zhuǎn)座復(fù)制,6對(duì)為隨機(jī)復(fù)制。

由表3可見:通過Ks來估計(jì)梨CLE基因的進(jìn)化時(shí)期或復(fù)制事件的時(shí)期,梨CLE基因?qū)Φ腒s值為0.011 9～2.046 3,表明復(fù)制時(shí)間最早發(fā)生在68.211 5百萬年前,最晚發(fā)生在0.395 7百萬年前。通過計(jì)算梨22個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks值,來估計(jì)驅(qū)動(dòng)PbrCLE多肽家族進(jìn)化的選擇壓力的種類。只有1對(duì)基因(PbrCLE4-PbrCLE13)的Ka/Ks值大于1,為陽性選擇,而其余基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1,表明這些基因主要通過純化選擇進(jìn)化而來。

表3 梨CLE多肽家族同源基因?qū)Φ腒a/Ks值Table 3 The Ka/Ks values of homologous gene pairs for CLE peptide family in pear

2.6 梨CLE基因在不同組織的表達(dá)模式

使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析梨CLE基因在不同組織中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)有2個(gè)基因未在所取材料中表達(dá)(PbrCLE2和PbrCLE6),其他33個(gè)基因至少在1個(gè)組織中表達(dá)[26]。由圖4可見:在莖中PbrCLE4、PbrCLE31和PbrCLE34表達(dá)量較高;PbrCLE11在葉和芽中表達(dá)量最高,其次是PbrCLE31;子房中表達(dá)量最高的是PbrCLE26;果實(shí)中大部分基因都未表達(dá),表達(dá)量最高的是PbrCLE31;花瓣中表達(dá)量最高的為PbrCLE29,其次為PbrCLE11和PbrCLE24;萼片中表達(dá)量最高的是PbrCLE24,其次為PbrCLE26和PbrCLE31。

圖6 PbrCLE12、PbrCLE24 和PbrCLE31在梨花柱不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression level of PbrCLE12,PbrCLE24 and PbrCLE31 at different developmental stages of pear style

分析梨CLE基因在不同花柱的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),結(jié)果顯示有13個(gè)基因在所取花柱材料中表達(dá)[27]。由圖5 可見:PbrCLE24和PbrCLE31在未授粉花柱、異交授粉花柱和自交授粉花柱中表達(dá)量均較高。進(jìn)一步以梨不同發(fā)育階段的花柱為材料,包括開花前5、3和1 d,開花當(dāng)天(開花0 d),開花后1和5 d,將3個(gè)CLE基因進(jìn)行RT-qPCR分析,結(jié)果(圖6)顯示:PbrCLE12和PbrCLE31表達(dá)量在花柱發(fā)育階段的變化趨勢(shì)基本一致,呈先下降再上升再下降的趨勢(shì);PbrCLE24表達(dá)量在花柱發(fā)育階段中先上升再下降。

圖5 PbrCLE基因在梨花柱中表達(dá)熱圖Fig.5 Expression heatmap of PbrCLE gene in pear style UP:未授粉花柱Unpollinated style;SP:自交授粉花柱Self-pollinated style;CP:異交授粉花柱Cross-pollination style.

圖4 PbrCLE基因在梨各組織中的表達(dá)熱圖Fig.4 Expression heatmap of PbrCLE gene among different tissues in pear Stem:莖;Leaf:葉;Ovary:子房;Ftuit:果實(shí);Bud:芽;Petal:花瓣;Sepal:萼片。紅色表示高表達(dá),藍(lán)色表示低表達(dá)。下同。Red indicates high expression and blue indicates low expression. The same as follows.

分析梨CLE基因在花粉發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[28],觀察到4個(gè)基因在花粉中有表達(dá)(圖7)。將4個(gè)CLE基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,結(jié)果(圖8)表明:花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度為RT-qPCR提供參照,PbrCLE3的表達(dá)量在花粉生長(zhǎng)前期一直保持較低的水平,在停止生長(zhǎng)的花粉(SPT)中表達(dá)量有明顯上升的趨勢(shì);PbrCLE7在水合的花粉(HP)和SPT中表達(dá)量較高;PbrCLE12在HP中表達(dá)量較高;PbrCLE28在正常生長(zhǎng)(PT)和SPT中表達(dá)量較高。

圖7 PbrCLE基因在梨花粉不同發(fā)育階段的表達(dá)熱圖Fig.7 Expression heatmap of PbrCLE gene at different developmental stages of pear pollenMP:花粉粒;HP:水合花粉粒;PT:生長(zhǎng)的花粉管;SPT:停止生長(zhǎng)的花粉管。下同。MP:Pollen grain;HP:Hydrated pollen grains;PT:Growing pollen tube;SPT:Stop growing pollen tube. The same as follows.

圖8 梨花粉不同發(fā)育階段的花粉萌發(fā)率、花粉管長(zhǎng)度以及基因相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Germination rate,pollen tube length and relative expression level of gene at different developmental stages of pear pollen a.梨花粉不同發(fā)育階段的花粉萌發(fā)率;b.梨花粉不同發(fā)育階段的花粉管長(zhǎng)度;c—f分別表示PbrCLE3、PbrCLE7、PbrCLE12和PbrCLE28在梨花粉不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量。a. Germination rate at different developmental stages of pear pollen ;b. Pollen tube length at different developmental stages of pear pollen;c-f indicate the relative expression levels of PbrCLE3,PbrCLE7,PbrCLE12 and PbrCLE28 at different developmental stages of pear pollen,respectively.

2.7 外源CLE多肽對(duì)梨花粉管生長(zhǎng)的影響

由圖9可見:合成多肽PbrCLE3、PbrCLE7、PbrCLE12和PbrCLE24對(duì)花粉管長(zhǎng)度無顯著作用,而PbrCLE31顯著抑制梨花粉管生長(zhǎng)。進(jìn)一步通過不同濃度的PbrCLE31多肽處理梨花粉,發(fā)現(xiàn)100 μmol·L-1PbrCLE31的抑制效果更明顯。

圖9 外源CLE多肽對(duì)梨花粉管生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect of exogenous CLE peptides on the growth of pear pollen a. 外源多肽PbrCLE31(100 μmol·L-1)處理后梨花粉管的生長(zhǎng)情況,bar=60 μm;b. 不同多肽處理對(duì)花粉管生長(zhǎng)的影響;c. 不同濃度PbrCLE31處理對(duì)花粉管長(zhǎng)度的影響。a. The growth of pear pollen tube after treatment with exogenous peptide PbrCLE31(100 μmol·L-1),bar=60 μm;b. The effect of different peptide treatments on pollen tube growth;c. Effect of different concentration of PbrCLE31 on the length of pollen tube. *P<0.05,**P<0.01.

3 討論

多肽激素CLE在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要調(diào)控作用,已在多個(gè)物種中鑒定到CLE基因。本研究從6個(gè)薔薇科物種中共篩選鑒定到91個(gè)CLE基因。根據(jù)薔薇科果樹和擬南芥的CLE多肽序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,將其分為4組(Group-A—Group-D)。Group-A是最大的組,其中,AtCLE10、AtCLE9、PbrCLE30、PmCLE1、PpCLE4和RoCLE9具有相同的基序。在擬南芥中,CLE9/10可通過不同的受體影響氣孔和維管束發(fā)育[29]。AtCLE17對(duì)擬南芥的莖尖分生組織(shoot apical meristem)活性有影響[30],并且可以影響根的發(fā)育[31]。AtCLE17、PbrCLE35、PbrCLE8、PbrCLE9和PmCLE2具有高度相似的基序,推測(cè)基序相同或者相似的基因可能具體相同的功能。在Group-B中,AtCLE1、AtCLE4和AtCLE7在根中顯示特定的表達(dá)模式,并參與調(diào)節(jié)擬南芥中根的結(jié)構(gòu)[32]。AtCLE3、AtCLE4、PbrCLE1、PbrCLE2、PbrCLE22和RoCLE2具有相同的基序,因此推測(cè)PbrCLE1、PbrCLE2、PbrCLE22和RoCLE2也可能參與根的發(fā)育。該組還包括研究最多的AtCLV3,AtCLV3被各種平行受體復(fù)合物所感知,從而限制了干細(xì)胞促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子WUS(WUSCHEL)的表達(dá),同時(shí)AtCLV3可以和WUS形成負(fù)反饋信號(hào)環(huán)路,目的是維持頂端分生組織中干細(xì)胞群的活性[33];而AtCLV3、PbrCLE16、PbrCLE21、PpCLE16和RoCLE12也具有幾乎相同的基序。在Group-C中,AtCLE25、AtCLE26和AtCLE45含有相似的CLE結(jié)構(gòu)域。在擬南芥中,CLE25和CLE45在調(diào)節(jié)根系結(jié)構(gòu)中起重要作用[34-35],表明該組的薔薇科成員可能同樣對(duì)根系發(fā)育也起著重要的調(diào)節(jié)作用。在Group-D中,與典型的Lys殘基相反,該組位置1是Ala殘基。與其他3個(gè)組相比,該組CLE基序的保守性最高。AtCLE41、AtCLE44、FvCLE1、PbrCLE13、PbrCLE31、PbrCLE4、PmCLE4、PmCLE7、PpCLE17和RoCLE1具有相同的CLE基序,AtCLE42、FvCLE2和RoCLE4具有相似的基序,這些成員都可以作為導(dǎo)管分子分化抑制因子(tracheary element differentiation inhibitory factor,TDIF)。TDIF抑制導(dǎo)管的分化,并促進(jìn)細(xì)胞增殖[36],表明這些薔薇科物種中CLE基因也可能具有相似功能。同時(shí)TDIF參與控制擬南芥中分生組織的增殖和分化[37]。因此,推測(cè)該組的薔薇科成員可能都具有可調(diào)節(jié)花序、葉片或枝條發(fā)育的功能。

基因復(fù)制的不同類型共同促進(jìn)了梨CLE多肽家族的進(jìn)化,主要包括全基因組復(fù)制(WGD)或片段復(fù)制(SD)、串聯(lián)復(fù)制(TD)、間隔復(fù)制(PD)、轉(zhuǎn)座復(fù)制(TRD)和隨機(jī)復(fù)制(DSD)[22,38]。不同的基因復(fù)制事件對(duì)基因家族的擴(kuò)展有不同的貢獻(xiàn)[39],梨基因組的所有成員主要發(fā)生2次全基因組重復(fù)事件,一個(gè)是三倍體加倍(γ)(Ks≈1.5～1.8),另一個(gè)是最近的全基因組復(fù)制(Ks≈0.15～0.30)[40-41]。本研究中梨CLE同源基因?qū)Φ腒s值為0.011 9～2.046 3,而且除了同源基因?qū)brCLE12-PbrCLE33(Ks=1.510 7)外,其他同源基因的Ks值都不在1.5～1.8內(nèi),說明大部分PbrCLE沒有經(jīng)過三倍體加倍過程。梨CLE同源基因?qū)χ?除了1對(duì)基因PbrCLE4-PbrCLE13外,Ka/Ks值均小于1,表明純化選擇是梨CLE多肽家族多樣化的主要進(jìn)化力量。

用化學(xué)合成的CLE多肽進(jìn)行體外處理是一種模擬內(nèi)源性CLE多肽功能的方法[10]。本研究根據(jù)表達(dá)模式選擇5個(gè)CLE多肽進(jìn)行合成,分別為花柱中表達(dá)的基因PbrCLE24和PbrCLE31,花粉中表達(dá)的基因PbrCLE3和PbrCLE7,在花粉和花柱中均有表達(dá)的基因PbrCLE12。通過體外處理梨花粉,發(fā)現(xiàn)PbrCLE31對(duì)梨花粉管生長(zhǎng)有一定的抑制作用,這為進(jìn)一步探明CLE多肽調(diào)控花粉管生長(zhǎng)的分子機(jī)制提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上,本研究通過生物信息學(xué)分析在薔薇科果樹中鑒定出91個(gè)CLE基因,為深入研究薔薇科果樹中多肽的功能奠定基礎(chǔ)。通過擬南芥中CLE基因的功能,推測(cè)了其同源物在梨中發(fā)揮的作用,其中PbrCLE31對(duì)梨花粉管生長(zhǎng)有抑制作用,但PbrCLE31調(diào)控梨花粉管生長(zhǎng)的信號(hào)路徑還需進(jìn)一步研究。