李曉晗,陳婧,鐘翔,周斌*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

RNA將基因信息從DNA傳遞到蛋白質(zhì),在中心法則里起著至關(guān)重要的作用。病毒RNA在轉(zhuǎn)錄后被調(diào)控以實現(xiàn)對其功能的控制[1-2]。宿主RNA在病毒感染過程中也存在轉(zhuǎn)錄后修飾,從而產(chǎn)生前病毒或抗病毒狀態(tài)[3-4]。對RNA深入研究后發(fā)現(xiàn)了更多的調(diào)控機制與功能,其中化學(xué)修飾至關(guān)重要[5]。19世紀(jì)50年代以來,已發(fā)現(xiàn)超過100種RNA修飾,廣泛分布于各種真核、原核細(xì)胞以及病毒中,它們主要存在于核糖體RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、非編碼小RNA(small non-coding RNA)、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)以及長鏈非編碼RNA(lncRNA)等各類RNA上。RNA修飾的種類復(fù)雜多樣,通過不同修飾實現(xiàn)不同的RNA功能,最終達(dá)到遺傳信息的多樣性[6-7]。目前RNA修飾主要包括6-甲基腺嘌呤(m6A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、1-甲基腺嘌呤(m1A)、5-羥甲基胞嘧啶(m5C)、假尿嘧啶(Ψ)等,這些不同的修飾分別在細(xì)胞內(nèi)具有特有的生物學(xué)功能。6-甲基腺嘌呤(m6A)作為真核細(xì)胞mRNA中比較常見的修飾方式[8],其功能研究也受到了很大重視。本文探討m6A在病毒感染中的作用。

1 m6A甲基化概述

m6A是一種比較常見甲基化修飾形式,其發(fā)生在腺嘌呤的第6位氮原子上,19世紀(jì)50年代時研究者首先在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了m6A的存在[9]，1974年,研究人員又發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞的mRNA中存在m6A修飾,隨后在研究中發(fā)現(xiàn)m6A修飾廣泛存在于自然界當(dāng)中,包括哺乳動物、小麥、玉米、果蠅、酵母細(xì)胞以及病毒等[10-11]。

以前,修飾核苷酸是通過水解或核酸酶消化放射性標(biāo)記的RNA,然后進(jìn)行色譜分析來檢測的。現(xiàn)在,基于測序的方法可以繪制m6A穿過細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組[12-14]的圖譜。這些方法可以識別含有m6A的特定RNA并確定具體修飾位點。最常用的全轉(zhuǎn)錄組m6A定位技術(shù)是MeRIP-seq(甲基化RNA免疫沉淀和測序,也稱m6A-seq)。mRNA上m6A修飾位點相當(dāng)保守,主要發(fā)生在DRACH(R:嘌呤;A:m6A;H:非鳥嘌呤)序列的腺嘌呤上,其中GGACU是最常見的基序[12-13]。DRACH基序與在Rous肉瘤病毒RNA中最初鑒定的m6A基序([G/A]A*C)一致[15-17]。雖然MeRIP-seq識別m6A富集片段,但沒有特定的DRACH靶點。目前所有的m6A映射技術(shù)都有幾個共同的局限性。它們都依賴于一種抗體,這種抗體會導(dǎo)致檢測偏差。來自不同供應(yīng)商的m6A抗體具有不同的特異性,而這些特異性可以被RNA結(jié)構(gòu)改變[18-19]。因為抗m6A抗體也可以識別類似的修飾2′-O-dimethyladenosine(m6Am)[20-23]。盡管存在局限性,目前轉(zhuǎn)錄體范圍內(nèi)的m6A作圖方法仍然可以明確m6A在病毒和細(xì)胞RNA中的定位。

圖1 m6A修飾相關(guān)分子機制Fig.1 Molecular mechanism of m6A modification

m6A功能的行使主要在甲基轉(zhuǎn)移酶(編碼器“Writers”)、去甲基化酶(消碼器“Erasers”)和結(jié)合蛋白(讀碼器“Readers”)的參與下進(jìn)行,三者共同調(diào)控m6A的發(fā)生,彼此緊密聯(lián)系,密不可分(圖1)。目前已發(fā)現(xiàn)了幾種甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物,主要成分包括甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3(methyltransferase like 3)、METTL14(methyltransferase like 14)、WTAP(Wilm’s tumor 1-associated protein)和KIAA1429(VIRMA)等,而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的去甲基化酶有FTO(fat mass and obesity-associated protein,FTO)和ALKBH5(α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 5)。在m6A修飾發(fā)揮其生物學(xué)功能中,結(jié)合蛋白的參與發(fā)揮了極其重要的作用。目前已知的結(jié)合蛋白有YT521-B同源性結(jié)構(gòu)域蛋白(YTH domain-containing proteins),包括 YTHDF1/2/3和YTHDC1/2以及核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,HNRNP)家族蛋白HNRNPA2B1、HNRNPC和HNRNPG[24]。近年來,RNA修飾的檢測技術(shù)不斷進(jìn)步,利用這些新技術(shù)發(fā)現(xiàn)m6A修飾能夠在一定程度上對真核生物轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行調(diào)節(jié),如mRNA的剪接、定位、出核、翻譯以及穩(wěn)定等。更多的m6A修飾機制有待進(jìn)一步發(fā)掘。

1.1 “Writers”蛋白催化m6A修飾形成

甲基轉(zhuǎn)移酶在1992年首次被發(fā)現(xiàn)[25],是催化m6A形成的相關(guān)蛋白。METTL3作為其重要的組成成分,相對分子質(zhì)量為70 000,包含2個甲基化的基序,主要定位于細(xì)胞核中[26-28],分別為S-腺苷硫氨酸(SAM)結(jié)合位點以及具有催化能力的DP-PW功能結(jié)構(gòu)域。通過分析METTL3的同源蛋白METTL14,發(fā)現(xiàn)其同樣具有S-腺苷硫氨酸結(jié)合位點以及具有催化能力的EOOL功能結(jié)構(gòu)域,因此,METTL14也可以說是甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的另一個組成成分。在進(jìn)行催化時,METTL3與METTL14按照1∶1比例形成了二聚體,共同發(fā)揮作用,這使得METTL3與METTL14的甲基化催化能力得到加強。METTL3和METTL14都定位在核剪接復(fù)合體核小斑(nuclear speckle)上,它是細(xì)胞核內(nèi)部的一個亞細(xì)胞器,并且有大量的剪切因子會幫助復(fù)合體發(fā)揮作用。WTAP是Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白,其在m6A甲基化修飾中同樣具有舉足輕重的地位,有助于協(xié)調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶的催化亞基METTL3-METTL14的定位,從而促進(jìn)m6A甲基化的形成。另外,WTAP還可能利用調(diào)控CDK2(cyclin-dependent kinase 2)的mRNA來使RCC細(xì)胞增殖,發(fā)生癌變,其也可能成為治療RCC的新的切入點。除此之外,最近對KIAA1429的研究表明其與m6A的形成也有關(guān)系,可能是甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的新亞基[29]。

1.2 “Erasers”蛋白催化m6A修飾消除

FTO于2011年首次被報道具有m6A去甲基化酶活性,這也讓m6A修飾成為了動態(tài)可逆的,與DNA或者蛋白質(zhì)的修飾相類似。隨后研究發(fā)現(xiàn),ALKBH5同樣也具有m6A去甲基化酶活性[30-31],并且它與FTO是同屬一個家族的蛋白。FTO是非血紅素Fe(Ⅱ)和α-KG依懶性雙加氧酶ALKB蛋白家族的成員,在FTO上含有Fe2+和α-酮戊二酸的結(jié)合位點,通過兩者共同作用能夠?qū)⒓谆D(zhuǎn)化為羥甲基并最終消除。FTO基因位于16號染色體,在人體各個發(fā)育階段都會表達(dá),研究發(fā)現(xiàn)FTO的主要功能為調(diào)節(jié)脂肪消耗的速度,調(diào)整機體的代謝率,使機體能量保持平衡,它與Ⅱ型糖尿病也有關(guān)系[32-33]。FTO可以將m6A氧化為N6-羥甲基腺苷(hm6A)以及N6-甲酰腺苷(f6A),有效去除體外以及細(xì)胞內(nèi)的m6A甲基化修飾。在HeLa和293T細(xì)胞系中,FTO基因敲除后mRNA上的m6A水平顯著提高,而FTO過表達(dá)后的結(jié)果恰恰相反。除此之外,通過小鼠試驗發(fā)現(xiàn),FTO過表達(dá)后,小鼠食量明顯增加,并且肥胖率激增[34],而與之相反的是,將小鼠的FTO基因敲除之后,小鼠體重下降明顯,生長發(fā)育受到嚴(yán)重抑制,機體的能量代謝增加,代謝不平衡[35-36]。因此,FTO具有的m6A去甲基化功能,使m6A修飾呈現(xiàn)動態(tài)可逆的形態(tài),這也是RNA上第1個可逆的動態(tài)修飾形式。而在FTO發(fā)現(xiàn)后不久,ALKBH5則被鑒定為m6A的第2種去甲基化酶。與FTO不同的是,ALKBH5在行使功能時并未形成中間產(chǎn)物,而是直接將m6A逆轉(zhuǎn)為腺苷。除此之外,研究還發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞中的去甲基化酶ALKBH5基因敲除后,m6A水平明顯增加,mRNA出核和RNA的代謝也受到了不同程度的影響[37]。在小鼠試驗中,將ALKBH5基因敲除后,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,減數(shù)分裂中期的精母細(xì)胞受到影響,從而導(dǎo)致雄性小鼠無法生育[34]。

1.3 “Readers”蛋白通過結(jié)合m6A修飾發(fā)揮功能

與m6A結(jié)合的RNA結(jié)合蛋白稱為“Readers(讀碼器)”。這些“Readers”蛋白可以調(diào)節(jié)靶RNA的穩(wěn)定性、剪接效率、多聚腺苷酸化、核輸出和翻譯效率等。研究發(fā)現(xiàn),YTH功能結(jié)構(gòu)域選擇性結(jié)合RNA上的m6A位點。目前發(fā)現(xiàn)的含有YTH功能結(jié)構(gòu)域的“Readers”蛋白主要有YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2共5種[38-39]。其中YTHDF1、YTHDF2以及YTHDF3比較相似,它們都包含一個C端的YTH功能結(jié)構(gòu)域[40],而YTHDC1和YTHDC2則與它們不具有同源性。

研究發(fā)現(xiàn),YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3多分布于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。YTHDF1不存在序列偏好性,它可以直接調(diào)控mRNA的3′UTR區(qū)域產(chǎn)生m6A修飾,從而促使mRNA進(jìn)行翻譯[41]。另外,YTHDF1還可以促進(jìn)底物mRNA與核糖體結(jié)合,或者作用于翻譯起始因子,介導(dǎo)翻譯的發(fā)生。YTHDF2與m6A的親和性要高于YTHDF1和YTHDF3,新檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)YTHDF2有3 000多個靶RNA,它可以通過募集CCR4-NOT腺嘌呤酶復(fù)合體來促進(jìn)mRNA的降解[42]。另外,YTHDF2還與介導(dǎo)mRNA翻譯的核糖體存在競爭作用,結(jié)合甲基化的mRNA并催化其降解,從而保持細(xì)胞中mRNA的穩(wěn)定。而且,當(dāng) mRNA處于m6A修飾狀態(tài)時,YTHDF2則會負(fù)反饋催化mRNA降解。YTHDF3則是與細(xì)胞內(nèi)RNA的代謝有關(guān),是YTHDF1及YTHDF2發(fā)揮功能的輔因子,其功能還有待進(jìn)一步研究。

與YTHDF蛋白不同的是,YTHDC1主要存在于細(xì)胞核中,其同樣具有多種調(diào)節(jié)控制作用,可以募集特定的剪切因子調(diào)節(jié)mRNA的剪切,促進(jìn)特定轉(zhuǎn)錄本衰變。此外,YTHDC1還可以通過絲氨酸/精氨酸剪切因子3使外顯子含量增加。YTHDC2蛋白是一個核質(zhì)蛋白,最近的研究表明,YTHDC2可以通過其解旋酶的作用調(diào)節(jié)m6A修飾,而更多的功能仍處于未知,有待進(jìn)一步研究。

2 病毒m6A修飾的研究

大約40多年前,人們在對病毒RNA進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn),某些病毒RNA中含有m6A修飾,例如甲型流感病毒(influenzaAvirus,IAV)、猴病毒40(Simianvirus40,SV40)、人類呼吸道合胞病毒(Humanrespiratorysyncytialvirus,RSV)和腺病毒(Adenovirus)等。由于當(dāng)時對m6A的研究較少,專業(yè)知識相對匱乏,相關(guān)試驗技術(shù)不成熟,所以對于病毒RNA中m6A功能的研究缺乏突破性進(jìn)展。近些年來,隨著MeRIP-Northern Blot和MeRIP-Seq等技術(shù)的發(fā)展,病毒RNA的m6A修飾機制被逐步解析出來。目前已發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus1,HIV-1)、黃病毒(Flavivirus)、IAV、SV40、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’ssarcoma-associatedherpesvirus,KSHV)和乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)的RNA中均存在m6A修飾,并且m6A修飾對于病毒的復(fù)制和病毒相關(guān)基因的表達(dá)都有著至關(guān)重要的影響(表1)。

表1 m6A對不同病毒復(fù)制的調(diào)控作用Table 1 Regulation of m6A on replication of different viruses

2.1 甲型流感病毒(IAV)

甲型流感病毒(IAV)包含1個分段的、單鏈負(fù)義RNA基因組,它是第一個被發(fā)現(xiàn)mRNA內(nèi)部存在m6A修飾的病毒。IAV的mRNA上存在m6A修飾位點約24個,而血凝素(HA)的mRNA上存在8個m6A修飾位點[43]。使用CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)敲除宿主細(xì)胞的甲基轉(zhuǎn)移酶METLL3基因,或者利用3-脫氮腺苷(3-deazaadenosine,3DAA,m6A修飾抑制劑)來抑制m6A修飾,都會使病毒的mRNA和蛋白(NS1和M2)的表達(dá)水平降低,最終使病毒復(fù)制受到抑制,而過表達(dá)YTHDF2則能促進(jìn)IAV的復(fù)制,使成熟的病毒粒子增加。研究發(fā)現(xiàn)“Readers”YTHDF1和YTHDF3能夠與IAV的RNA結(jié)合,但是這種結(jié)合不影響IAV的復(fù)制以及病毒粒子的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究表明,在小鼠模型中,血凝素(HA)RNA上產(chǎn)生的2種m6A位點同義突變使所產(chǎn)生的2種病毒的復(fù)制能力和致病性都有一定程度的降低[44]。這些結(jié)果表明IAV的RNA復(fù)制與基因的表達(dá)都受m6A修飾影響。

2.2 腸道病毒71型(EV71)

腸道病毒71型(EV71)是單鏈RNA病毒,屬于微小病毒科中的腸病毒群,其基因組大小為7.5 kb,強致病性[45-46]。研究發(fā)現(xiàn)EV71的RNA上存在m6A修飾,在病毒入侵宿主的過程中,病毒也會反向影響m6A 修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)情況[47]。甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3mRNA水平的下降使EV71的RNA水平下調(diào),而FTO蛋白豐度上升則會使EV71的RNA水平明顯上升。如果EV71的RNA上的m6A位點發(fā)生突變,會減少成熟的病毒粒子釋放。另外,METTL3可以通過對病毒RNA依賴性聚合酶3D的正向調(diào)節(jié)作用使EV71病毒粒子增加。

2.3 猴空泡病毒(SV40)

猴空泡病毒SV40是一種在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的小型雙鏈DNA病毒,它隸屬于多瘤病毒家族,其RNA中也含有m6A。雖然m6A在SV40的mRNA中已存在數(shù)十年[48-49],但直到最近才完全了解m6A在病毒mRNA上的確切位置以及它如何調(diào)控病毒的復(fù)制。m6A位于2個SV40轉(zhuǎn)錄本中,研究人員采用PA-m6A-seq方法,在SV40病毒的早期區(qū)域發(fā)現(xiàn)2個m6A修飾位點,而在SV40病毒的晚期區(qū)域發(fā)現(xiàn)11個m6A修飾位點。通過過表達(dá)“Readers”蛋白YTHDF2和YTHDF3,發(fā)現(xiàn)SV40的增殖明顯增加,而敲除YTHDF2和“Writers”蛋白METTL3會明顯抑制SV40增殖。除此之外,將晚期mRNA上的m6A位點進(jìn)行突變,SV40的增殖同樣受到抑制。這些結(jié)果都表明,m6A修飾在SV40復(fù)制周期起到了積極的調(diào)控作用[50]。

2.4 呼吸道合胞病毒(RSV)

人類呼吸道合胞病毒(RSV)是一種包膜病毒,屬于肺炎病毒科。RSV會引起下呼吸道感染,主要針對嬰兒、幼兒和免疫功能低下的個體。有研究表明,RSV的基因組、抗原組和mRNA在特定的位點內(nèi)存在m6A甲基化,并且對HeLa和A549細(xì)胞中RSV的復(fù)制、基因表達(dá)和病毒產(chǎn)生有積極的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)m6A“Readers”蛋白過度表達(dá)時,RSV的復(fù)制明顯增強,而敲除“Readers”蛋白則抑制了RSV的基因表達(dá)和復(fù)制?！癊rasers”蛋白的情況則正好相反。由于RSV G蛋白基因轉(zhuǎn)錄本含有較多的m6A修飾,很可能增強了其穩(wěn)定性,使更多的翻譯成為可能,這可能導(dǎo)致更多的G蛋白插入到病毒粒子中,并增強病毒的組裝和感染性病毒粒子的產(chǎn)生。然而,細(xì)胞中的G蛋白一部分以可溶性形式釋放,從而影響白細(xì)胞遷移。增強G蛋白的表達(dá)可促進(jìn)可溶性G蛋白的產(chǎn)生,從而影響機體對RSV的免疫應(yīng)答。病毒RNA的m6A修飾也可能幫助病毒逃避宿主先天免疫的監(jiān)視,從而實現(xiàn)有效基因的表達(dá)和病毒復(fù)制。研究還發(fā)現(xiàn),由于RSV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄需要持續(xù)的蛋白質(zhì)合成,病毒G蛋白表達(dá)的減少將影響所有病毒蛋白的表達(dá),從而導(dǎo)致第2輪病毒整體復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的減少。缺乏特定m6A簇的表達(dá)G轉(zhuǎn)錄本的重組RSV突變體在A549細(xì)胞、原代分化良好的人呼吸道上皮細(xì)胞和棉鼠呼吸道細(xì)胞中的復(fù)制減少,其中1種m6A缺陷型變異體在棉鼠體內(nèi)毒力大大降低,但仍保持高免疫原性[51]。此外,通過對RSV基因序列分析,宿主m6A可能與RSV核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物相互作用。這些結(jié)果表明,病毒m6A修飾機制可用于減毒活疫苗的設(shè)計,可提高減毒活疫苗產(chǎn)量,也為發(fā)現(xiàn)廣譜抗病毒藥物提供新思路。

2.5 人乳頭瘤病毒(HPV)

人乳頭瘤病毒(HPV)屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬,是球形DNA病毒,能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖,誘發(fā)宮頸癌等疾病。研究發(fā)現(xiàn)FTO在宮頸癌組織中經(jīng)常過表達(dá),并與腫瘤的發(fā)生呈正相關(guān),功能性FTO(不是無去甲基化酶活性的突變型FTO)可以調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移。在機制上,FTO直接與轉(zhuǎn)錄因子1(transcription factor 1,E2F1)基因和癌基因MycmRNA相互作用,抑制FTO可顯著抑制這2個重要癌基因的翻譯,從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移。進(jìn)一步研究表明,FTO可以直接調(diào)節(jié) 2個重要致癌因子E2F1和Myc的翻譯,過表達(dá)E2F1或Myc可以充分恢復(fù)FTO缺陷細(xì)胞的增殖和遷移能力。因此,m6A去甲基酶FTO在調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移中起重要作用,其致癌作用依賴于其去甲基酶活性。這也表明靶向FTO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是宮頸癌治療的一種有前途的策略[52]。

2.6 寨卡病毒(ZIKV)

研究發(fā)現(xiàn)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的缺失或過度表達(dá)能夠影響ZIKV的復(fù)制,RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的缺失,可以使病毒復(fù)制增加;與之相對應(yīng)的是,RNA去甲基化酶的消除可以抑制病毒的復(fù)制。另外,宿主RNA甲基轉(zhuǎn)移酶機制是ZIKV的負(fù)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子RNA甲基轉(zhuǎn)移酶能夠加速病毒裂解,使轉(zhuǎn)錄本降解。m6A對病毒復(fù)制的影響可能是通過調(diào)節(jié)病毒RNA代謝進(jìn)行的,YTHDF家族蛋白調(diào)節(jié)m6A修飾RNA的穩(wěn)定性,其可以與ZIKV RNA結(jié)合,并且沉默后增加了ZIKV的復(fù)制。對宿主mRNA的m6A甲基化分析表明,ZIKV感染改變了mRNA中的m6A位置以及由甲基轉(zhuǎn)移酶修飾的靶基因[53]。

2.7 乙型肝炎病毒(HBV)

乙型肝炎病毒(HBV)的基因組為DNA,通過前基因組RNA(pregenomic RNA,pg RNA)這樣的形式實現(xiàn)自身的復(fù)制。大部分pg RNA會被翻譯成病毒蛋白,其余部分經(jīng)過pol亞基和core亞基包裹后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生成熟的核衣殼。分別對慢性乙型肝炎患者的肝組織以及HBV表達(dá)的細(xì)胞中的HBV RNA進(jìn)行檢測,在其中均發(fā)現(xiàn)m6A修飾的存在。另外,“Readers”蛋白YTHDF2和YTHDF3都能夠結(jié)合HBV RNA[54]。將HBV蛋白中的“Writers”蛋白METTL3和METTL14的基因沉默之后,HBV蛋白的表達(dá)與RNA的穩(wěn)定性都有所增加,而pg RNA的逆轉(zhuǎn)錄會受到抑制;與之對應(yīng)的是,將HBV蛋白中的“Erasers”蛋白FTO的基因沉默之后,HBV蛋白的表達(dá)與RNA的穩(wěn)定性都有所降低,而pg RNA的逆轉(zhuǎn)錄則會增加。

2.8 丙型肝炎病毒(HCV)

METTL3—METTL14至少有一部分存在于細(xì)胞質(zhì)中,在細(xì)胞質(zhì)中它可以與病毒RNA相互作用并使其甲基化[55]。在HCV感染的細(xì)胞內(nèi),核孔復(fù)合蛋白被招募到HCV復(fù)制的膜位點,同時METTL3也被招募到該位點,這可能源于METTL3上存在核定位信號[56]。在HCV感染期間,m6A修飾對感染病毒粒子的產(chǎn)生存在負(fù)調(diào)控。具體來說,HCV RNA的E1基因中的m6A抑制病毒RNA包裝成感染性顆粒,可能是通過促進(jìn)與m6A結(jié)合的YTHDF蛋白和被m6A排斥的HCV核心蛋白之間的競爭實現(xiàn)的。有趣的是,在HCV感染期間,這些YTHDF蛋白重新定位到脂滴處的病毒離子組裝位點。這些發(fā)現(xiàn)支持了YTHDF蛋白識別m6A對病毒RNA包裝有抑制作用的觀點。事實上,細(xì)胞內(nèi)的HCV RNA比胞外病毒相關(guān)的HCV RNA[55,57]含有更多的m6A修飾。這表明HCV以及其他可能的黃病毒RNA m6A修飾在不同的生命周期可能是不同的。然而,在不同的生命周期,導(dǎo)致這種差異性改變的機制仍然是未知的。重要的是,雖然改變m6A的表達(dá)可以改變HCV水平,但它并不影響幾個已知的干擾素(interferon,IFN)刺激基因(interferon stimulated genes,ISG)的表達(dá),這表明m6A水平的改變不會影響HCV感染產(chǎn)生的整體抗病毒反應(yīng)。

2.9 卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)

KSHV是一種致癌的皰疹病毒。研究發(fā)現(xiàn),KSHV通過潛伏基因的表達(dá)實現(xiàn)在宿主細(xì)胞內(nèi)的潛伏感染。與其他皰疹病毒一樣,KSHV的感染存在潛伏感染(latent infection)和裂解復(fù)制(lytic replication)2種時期。在裂解復(fù)制中,KSHV按照早期基因到晚期基因的順序依次表達(dá)蛋白。KSHV的生命周期受到m6A修飾影響,表現(xiàn)為KSHV的 mRNA的m6A修飾水平在裂解復(fù)制時會顯著提高[58]。將KSHV基因組中的去甲基化蛋白FTO基因沉默之后,裂解基因的表達(dá)量增加,而將KSHV基因組中的甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3基因沉默之后,裂解基因的表達(dá)量則會減少;同樣,利用甲氯酚那酸(meclofenamic acid,MA)抑制“Erasers”蛋白FTO的活性后,其裂解基因的表達(dá)量增加,而使用DAA抑制m6A修飾則會使裂解基因表達(dá)量減少,病毒粒子產(chǎn)生隨之減少。Hesser等[59]報道,感染KSHV后細(xì)胞的m6A水平明顯升高,但是沉默不同細(xì)胞系的m6A修飾,將對KSHV的基因表達(dá)產(chǎn)生不同影響。在iSLK.219和iSLK.BAC16細(xì)胞中,METTL3和“Readers”YTHDF2蛋白表達(dá)水平降低,會影響轉(zhuǎn)錄激活因子ORF50,使其蛋白豐度下降,最終KSHV的滴度下降,這表明m6A可以促進(jìn)KSHV的增殖。與之對應(yīng)的是,KSHV感染B細(xì)胞后,METTL3或者“Readers”YTHDF2蛋白的缺失則會讓ORF50蛋白豐度增加,進(jìn)而使KSHV滴度增加。雖然不同細(xì)胞系中m6A修飾對KSHV的影響不同,但是可以表明m6A通過ORF50來調(diào)控KSHV的復(fù)制。另外,最新的研究表明,KSHV RNA在病毒的潛伏期和裂解復(fù)制期內(nèi)都存在大量的m6A修飾,并且這些修飾在不同細(xì)胞類型和感染系統(tǒng)中高度保守。另外,“Readers”蛋白YTHDF2還可以通過促進(jìn)病毒RNA降解,進(jìn)而抑制KSHV裂解復(fù)制。這些結(jié)果說明在KSHV生命周期中,m6A修飾有至關(guān)重要的作用。

2.10 人類免疫缺陷病毒Ⅰ型病毒(HIV-1)

HIV-1為人類免疫缺陷病毒Ⅰ型病毒,是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒,屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒。在HIV-1進(jìn)行復(fù)制時,m6A修飾對mRNA的帽子依賴、非依賴性翻譯、出核和選擇性剪切等過程起著至關(guān)重要作用。因此,m6A修飾在HIV-1感染中很可能發(fā)揮重要作用[60]。

m6A 甲基化的RNA免疫沉淀(m6A-methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP)和光交聯(lián)輔助的m6A測序(photo-crosslinking-assisted m6A-sequencing,PA-m6A-Seq)結(jié)果顯示,HIV-1的RNA含有m6A修飾并且m6A在3′UTR富集[61]。HIV-1感染后宿主與病毒mRNA的m6A豐度都會升高。通過shRNA介導(dǎo)甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14以及去甲基化酶ALKBH5基因的沉默,發(fā)現(xiàn)METTL3和METTL14的沉默可以使GP120、p24RNA水平降低,而沉默ALKBH5使這2個基因的RNA水平升高[62],說明m6A的修飾水平與GP120和p24RNA豐度呈正相關(guān)。另外,發(fā)生在HIV-1 Rev響應(yīng)原件(Rev responsive element,RRE)RNA莖環(huán)Ⅱ區(qū)域的保守腺苷(A7883)的m6A修飾可以促進(jìn)Rev蛋白與其結(jié)合,進(jìn)而促使RNA向胞質(zhì)轉(zhuǎn)運,最終使HIV-1增殖。此外,Tirumuru等[63]觀察到在HeLa細(xì)胞中存在過表達(dá)m6A識別蛋白YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3時,HIV的滴度降低,其中YTHDF2的抑制作用最為顯著,其效果類似于疊氮胸苷(zidovudine,AZT),說明m6A識別蛋白YTHDF1、2和3可能通過某種機制抑制HIV的復(fù)制。

圖2 m6A影響RNA病毒復(fù)制及基因表達(dá)的機制Fig.2 Mechanism of m6A affecting RNA virus replication and gene expression

2.11 植物病毒

與哺乳動物相比,目前對植物病毒m6A修飾功能的研究很少,而植物病毒對植物正常生長發(fā)育有嚴(yán)重的威脅。Martínez-Pérez等[64]通過酵母雙雜交篩選,利用擬南芥苜?；ㄈ~病毒(Alfalfamosaicvirus,AMV)和衣殼蛋白(capsid protein,CP)的相互作用,鑒定去甲基化酶ALKB家族的成員atALKBH9B。另外,研究表明,在擬南芥轉(zhuǎn)錄體寬譜超過2/3的mRNA[65]中檢測到了m6A修飾。擬南芥中的METTL3同系物在植物發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[66-67]。此外,擬南芥FIP37蛋白是WTAP的一個植物同源物,在體內(nèi)外與MTA相互作用,是介導(dǎo)莖分生組織mRNA m6A修飾的關(guān)鍵[66,68]。然而,目前還沒有脫甲基酶或YTHDF影響植物病毒活性的描述。擬南芥基因組包含13個大腸桿菌AlkB(atALKBH1-10B)同源基因[68]。盡管這些蛋白質(zhì)的功能特性尚未見報道,但亞細(xì)胞定位研究表明,除了定位于葉綠體的atALKBH1D和僅定位于細(xì)胞質(zhì)的atALKBH9B之外,所有這些蛋白質(zhì)都顯示出核質(zhì)定位模式[69]。有趣的是,在不同植物病毒復(fù)制酶基因的ORF中發(fā)現(xiàn)了AlkB結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域在體外能夠從RNA和DNA中去除m1A和m3C修飾,這表明復(fù)制酶蛋白在逆轉(zhuǎn)病毒基因組甲基化修飾中的作用。除此之外,研究[64]發(fā)現(xiàn)AMV和CMV這2個雀麥花葉病毒科成員的基因組中同樣有m6A的存在,并且將去甲基化酶atALKBH9B突變后,AMV基因組中m6A水平明顯上升。進(jìn)一步研究表明,atALKBH9B與小干擾RNA(siRNA)的組成部分SGS3以及P-body中的降解酶DCP1完全重疊,這也表明m6A修飾對AMV復(fù)制的調(diào)節(jié)很可能是通過mRNA的沉默和衰減來進(jìn)行的。

雖然病毒RNA的m6A修飾是在幾十年前發(fā)現(xiàn)的,但近兩年來僅有少量研究證據(jù)表明,這種普遍存在的動態(tài)表位轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象可能在許多病毒中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。不同病毒的m6A修飾對其復(fù)制的影響不盡相同(圖2)。IAV、EV71、SV40、RSV、HPV等病毒的m6A修飾對其復(fù)制有促進(jìn)作用;而AMV、AIKV、HBV、HCV、KSHV等病毒的m6A修飾則產(chǎn)生了完全相反的影響;而像HIV-1等病毒,m6A修飾對其復(fù)制的影響還有待進(jìn)一步研究。精確的m6A定位方法的發(fā)展為我們對m6A功能的理解奠定了基礎(chǔ)。在病毒生命周期中,去除宿主m6A機制和取消特定位點的甲基化仍然是確定m6A功能不可缺少的方法。然而,特定修飾位點的靶向甲基化或去甲基化,雖然在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性,但毫無疑問可以更好闡明m6A的功能。此外,m6A在抑制其他病毒的同時積極調(diào)節(jié)某些病毒復(fù)制的能力仍然是一個關(guān)鍵問題,值得我們不斷去探索研究。同樣,目前還不清楚宿主表位編碼組的變化,無論是促進(jìn)還是抑制病毒復(fù)制,在調(diào)節(jié)病毒感染方面都起著重要作用。而這些關(guān)鍵問題的解決可能會讓我們更深一步理解m6A在病毒-宿主相互作用中發(fā)揮的作用,并給病毒研究帶來新的啟示。

3 m6A修飾對免疫反應(yīng)的影響

免疫系統(tǒng)是機體的安全衛(wèi)士,是高等生物抵御病毒入侵的重要保護(hù)屏障,對清除病原體起著至關(guān)重要的作用。目前對于m6A修飾在免疫系統(tǒng)中的作用和m6A修飾在宿主與病原體中的相互作用研究還比較少。先天性免疫反應(yīng)是快速和非特異性的,作為應(yīng)對病毒感染的第一反應(yīng),先天免疫系統(tǒng)通過區(qū)分病原體和宿主核酸,對病毒感染提供第一反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),RNA m6A在先天免疫應(yīng)答中的作用仍然是矛盾的。一方面,RNA解旋酶家族成員DDX46與ALKBH5相互作用,使m6A標(biāo)記的抗病毒轉(zhuǎn)錄本( MAVS、TRAF3和TRAF6)去甲基化,導(dǎo)致它們在細(xì)胞核內(nèi)滯留并抑制了之后的翻譯。因此,DDX46抑制病毒感染后的Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)信號級聯(lián)反應(yīng),這提示m6A在先天性抗病毒反應(yīng)中起積極作用[70]。另一方面,m6A調(diào)節(jié)是IFN-Ⅰ誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)中的負(fù)調(diào)節(jié)因子。在病毒感染過程中,甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3和讀碼器蛋白YTHDF2的過表達(dá)提高了干擾素IFNβ轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾水平,降低了它的穩(wěn)定性,抑制了IFNβ的表達(dá)和免疫應(yīng)答[71]。除了宿主轉(zhuǎn)錄物外,含有核苷酸修飾的病毒核糖核酸可以中斷胞漿內(nèi)維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-Ⅰ)樣的先天免疫信號傳導(dǎo)[72]。另外,Liu等[73]研究水泡型口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后宿主細(xì)胞m6A水平的變化,發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞可以通過削弱ALKBH5的去甲基化活性來積極對病毒感染做出反應(yīng),這會導(dǎo)致增加的酮戊二酸脫氫酶(a-ketoglutarate dehydrogenase,OGDH)mRNA衰減,使OGDH蛋白表達(dá)下降,從而對細(xì)胞代謝狀態(tài)進(jìn)行重編程而使得宿主對病毒感染產(chǎn)生不依賴于IFN-I的抵抗力。下降的OGDH表達(dá)限制三羧酸循環(huán)并減少病毒復(fù)制所需的衣康酸的產(chǎn)生,因而限制宿主細(xì)胞中的病毒感染,證明RNA表觀遺傳與細(xì)胞代謝協(xié)同抵御病毒感染,為病毒感染性疾病的干預(yù)與治療提供潛在藥物靶點。

4 結(jié)語

m6A 是真核生物中最豐富的RNA 修飾,越來越多的研究表明其對病毒的復(fù)制有著重要的影響。隨著對其修飾機制的深入研究,發(fā)現(xiàn)m6A對RNA水平的調(diào)控越來越復(fù)雜多樣。m6A修飾功能的行使是通過編碼器“Readers”蛋白來實現(xiàn)的:一方面,“Readers”蛋白能夠促進(jìn)m6A 修飾mRNA的翻譯;另一方面,在某些情況下,“Readers”蛋白也會通過降低靶mRNA的穩(wěn)定性,促進(jìn)其降解。因此,有關(guān)其調(diào)控功能的具體機制還有待進(jìn)一步探究。而對m6A修飾在病毒復(fù)制過程中調(diào)控機制的研究表明,m6A修飾對于病毒復(fù)制的調(diào)控是通過影響病毒mRNA或基因組RNA的穩(wěn)定來實現(xiàn)的[75]。在m6A修飾過程中,將甲基化轉(zhuǎn)移酶基因沉默之后,HIV和IAV復(fù)制會受到抑制;反之,將去甲基化酶基因沉默之后,則促進(jìn)HIV和AIV的復(fù)制,但是在HCV和ZIKV上進(jìn)行同樣的試驗,卻產(chǎn)生了相反的結(jié)果。雖然同樣是RNA病毒,都具有m6A修飾,但是結(jié)果大相徑庭,可見m6A對不同病毒的調(diào)控是不同的,可能受到許多因素的影響[76]。此外,病毒RNA的高甲基化使部分病毒能夠成功躲避免疫系統(tǒng)的識別,那么是否有某些方法檢測這些生物體異常變化還需要進(jìn)一步的研究?？偟膩碚f,m6A通過調(diào)節(jié)特定的RNA來調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的許多方面,有時依賴于組織或細(xì)胞類型[77]。今后研究在病毒感染期間的m6A時應(yīng)著重于特定修飾位點在單個轉(zhuǎn)錄本中的作用、修飾的時間動態(tài)以及新發(fā)現(xiàn)的m6A“Readers”蛋白及其功能。此外,還應(yīng)該進(jìn)行體外細(xì)胞試驗,或加入動物模型等,例如利用甲基化轉(zhuǎn)移酶基因METTL3、METTL14或者是去甲基化酶FTO基因敲除的鼠進(jìn)行更深一步的研究。到目前為止,我們對m6A在病毒感染中的作用認(rèn)識較少,具體的機制需要進(jìn)一步研究發(fā)掘。