張玲玲，周 潔，秦曼麗， 周 弦，吳 林，劉奕清

1. 長江大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434000；2. 重慶市幅沅農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究院有限公司，重慶 永川 402160；3. 重慶文理學(xué)院特色植物研究院，重慶 永川 402160

生姜(ZingiberofficinaleRosc.)為姜科(Zingiberaceae)多年生宿根性草本植物，是主要香辛保健蔬菜之一，也是醫(yī)藥及化工產(chǎn)品的重要原料[1]．我國生姜栽培歷史悠久，是世界上生姜生產(chǎn)、出口、消費(fèi)第一大國[2]．近年來，我國生姜種植面積不斷增大，但生姜產(chǎn)區(qū)連年重茬，各種病害日益嚴(yán)重．其中，生姜青枯病又稱姜瘟病，是一種世界性的土傳細(xì)菌病害，嚴(yán)重制約了生姜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]．

青枯病是一種嚴(yán)重危害作物種植生產(chǎn)的毀滅性土傳細(xì)菌病害，其病原菌寄主范圍廣，可侵染包括生姜、番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯等50個(gè)科的400多種植物[4-5]．生姜青枯病的病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)、種內(nèi)分化和致病機(jī)理復(fù)雜[6]，其發(fā)生與流行受土壤濕度、溫度和種植方式等多種因素的影響[7]，目前尚無理想的防治手段和生姜抗病品種[8]．前人采用組織分離法已對安徽[9]、四川[10]、海南[11]等地的生姜青枯病病原菌進(jìn)行過鑒定．湖北省作為生姜的重要種植地區(qū)，近年來青枯病頻發(fā)，田間發(fā)病率在30%～50%，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收．然而，關(guān)于湖北生姜青枯病病原菌的研究仍鮮有報(bào)道．為此，明確湖北生姜青枯病的病原菌，可為該病有效防治提供基礎(chǔ)．

為防止帶菌姜種和帶菌土壤引起的生姜青枯病的傳播，建立快速準(zhǔn)確的生姜青枯病菌檢測方法對生姜種植過程重大土傳病害的早期檢測與預(yù)警防控有重要意義．傳統(tǒng)的青枯病病原菌檢測包括癥狀觀察、分離純化等手段，操作復(fù)雜且時(shí)效性差，還極易與其他病害混淆，難以快速準(zhǔn)確鑒定，不能滿足生產(chǎn)實(shí)際的需要[12]．分子檢測方法已成為當(dāng)前主要的病原菌檢測手段，不僅能應(yīng)用于田間病害的早期診斷預(yù)警，而且還能滿足種子潛伏期檢疫的要求[13]．PCR檢測技術(shù)是最常用的植物病原菌分子檢測方法，具有成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，已在植物組織及土壤病原菌檢測方面得到了廣泛運(yùn)用[14]．例如，鐘鑫等運(yùn)用普通PCR技術(shù)分子體系在抗病品種接種1～5 d后檢測出西瓜枯萎病病菌[15]，Martínez-Espinoza等利用PCR技術(shù)在玉米染病早期或者無癥狀感染時(shí)檢測玉米瘤黑粉病病菌[16]，張凱東等采用PCR和序列測定技術(shù)對柑桔葉樣進(jìn)行了黃龍病菌檢測等[17]．迄今為止，生姜青枯病的PCR檢測技術(shù)尚未見報(bào)道．

為了明確引起湖北恩施地區(qū)生姜青枯病的病原菌以及建立快速準(zhǔn)確的檢測方法，以取自湖北恩施地區(qū)的生姜病樣進(jìn)行分離純化，基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測定和分子生物學(xué)的方法對其進(jìn)行鑒定．檢索查詢國內(nèi)外關(guān)于青枯菌的分子檢測報(bào)道，篩選了青枯雷爾氏菌的特異性擴(kuò)增引物，優(yōu)化了PCR快速檢測方法，旨在為生姜青枯病害的田間早期預(yù)警、姜種檢疫診斷及綠色防控提供技術(shù)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材 料

疑似生姜青枯病病株采自湖北恩施(109°41′48″E，30°03′30″N)，健康生姜植株種于長江大學(xué)玻璃溫室中．生姜青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供；番茄青枯菌(R.solanacearum)、土豆青枯菌(R.solanacearum)、藿香青枯菌(R.solanacearum)、煙草青枯菌(R.solanacearum)、變黃假單胞菌(Pseudomonasflavescens)、臺灣假單胞菌(Pseudomonastaiwanensis)、谷關(guān)假單胞菌(Pseudomonasentomophila)、大黃魚致病性香魚假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)、胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumaroidearum)、路氏腸桿菌(Enterobacterludwigii)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterseifertii)、成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)、解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)均由長江大學(xué)香辛作物研究院實(shí)驗(yàn)室保存．

1.2 方 法

1.2.1 生姜病樣采集與病原菌分離

2019年8月于湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣生姜種植基地采集具有典型青枯病癥狀的生姜植株，將病樣帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離．

生姜青枯病病原菌的分離參照任欣正等[18]的方法，略有改進(jìn)．用無菌手術(shù)刀截取生姜病株根莖部的病健交界處組織，剝?nèi)ネ獗砥?，置于裝有50 mL無菌水的三角瓶中，37 ℃、150 r/min振蕩，待無菌水稍有渾濁后，用接種環(huán)蘸取少量液體，在TTC培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，長出的菌落用于后續(xù)的致病力測定．

1.2.2 致病力測定

將分離得到的病菌在TTC培養(yǎng)基平板上重新劃線，30 ℃培養(yǎng)36 h后挑取單菌落在TTC液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，調(diào)整細(xì)菌濃度為107cfu/mL后進(jìn)行致病力測定試驗(yàn)．選取生長60 d且長勢一致的盆栽生姜苗，用無菌的4號注射器吸取1 mL菌液，采用莖基部注射接種法在生姜植株的莖基部進(jìn)行接種，以無菌水為陰性對照，每個(gè)處理重復(fù)接種20盆．在接種第3 d后調(diào)查發(fā)病情況，在接種第15 d后計(jì)算病情指數(shù)．青枯病病情共分成5個(gè)等級[19]．0級： 植株長勢健康；1級： 1個(gè)葉片枯萎；2級： 2至3個(gè)葉片枯萎；3級： 3片(含)以上葉片枯萎；4級： 植株死亡．統(tǒng)計(jì)病株率及病情指數(shù)，判定致病力強(qiáng)弱．根據(jù)柯赫氏法則重新對接種發(fā)病的生姜植株進(jìn)行病原分離鑒定，觀察與原分離病菌是否一致．選取致病力強(qiáng)的菌株進(jìn)行病原菌的下一步鑒定．

病株率=發(fā)病株數(shù)/接種總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總株數(shù) × 最高級代表值) ×100

1.2.3 生姜青枯病病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定： 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]，將平板上菌落顏色和形狀與青枯雷爾氏菌相似的單菌落重新接到TTC平板上，觀察菌落的形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微和掃描電鏡下觀測其形態(tài)特征．

分子生物學(xué)鑒定： 采用CTAB/NaCl法提取菌株基因組DNA，以提取的DNA為模板，通過細(xì)菌16SrDNA通用引物16S-F/16S-R(16S-F： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16S-R： 5’-TCGGCTACCTTGTTACGACAC-3’，由武漢華大基因科技服務(wù)有限公司合成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，無菌去離子水為陰性對照．PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃補(bǔ)齊10 min，循環(huán)30次．?dāng)U增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，送武漢華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序，并對測序的結(jié)果進(jìn)行拼接，得到菌株的16S rDNA擴(kuò)增片段的序列信息，并將其在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析．另外，在NCBI上選取不同細(xì)菌的16S rDNA序列，使用MEGA7.0軟件，通過鄰接法(neighbor-joining method)來構(gòu)建分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹．

生理小種和生物型鑒定： 根據(jù)菌株對不同寄主的致病性確定所屬的生理小種[21]．選取生長10 d的生姜、番茄、茄子、馬鈴薯、煙草和辣椒的健康植株，采用莖基部接種法，在植株莖基部注射濃度為107cfu/mL的菌液，以注射無菌水為陰性對照，每種植物重復(fù)接種10盆．在接種后的第7 d記錄發(fā)病植株數(shù)量，并以發(fā)病率為指標(biāo)來統(tǒng)計(jì)青枯菌對不同植物的致病力．參考呂志強(qiáng)等[22]的青枯雷爾氏菌生物型劃分標(biāo)準(zhǔn)，分別以乳糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇和甜醇作為培養(yǎng)基的碳源，根據(jù)菌株對碳源的利用情況來確定生物型．

1.2.4 生姜青枯病病原菌PCR檢測方法的建立及優(yōu)化

根據(jù)國內(nèi)外關(guān)于生姜青枯病病原菌的分子檢測報(bào)道，篩選出特異性引物21R/21F(21F： 5’-CGACGCTGACGAAGGGACTC-3’；21R： 5’-CTGACACGGCAAGCGCTCA-3’)[23]，引物由武漢華大基因科技服務(wù)有限公司合成．對影響PCR方法的退火溫度、延伸時(shí)間及循環(huán)次數(shù)重要因素進(jìn)行優(yōu)化．選用不同的退火溫度58.8 ℃設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)程序，共設(shè)計(jì)58 ℃，58.2 ℃，58.8 ℃，59.8 ℃，61.1 ℃，62.8 ℃，64.8 ℃，66.6 ℃，67.9 ℃，69.0 ℃，69.6 ℃，70 ℃ 12個(gè)溫度梯度，3個(gè)延伸時(shí)間分別設(shè)為30 s，45 s和1 min，3個(gè)循環(huán)次數(shù)分別設(shè)為30，35，40次，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)重復(fù)．結(jié)果按照病原菌擴(kuò)增的特異性和敏感性，即條帶的強(qiáng)弱、雜帶的有無，并結(jié)合Alphalmaher TM 2200軟件進(jìn)行綜合評價(jià)[24]．

1.2.5 PCR反應(yīng)特異性和靈敏度檢測

特異性檢測： 對分離得到的生姜青枯菌基因組DNA，分別以番茄青枯菌、土豆青枯菌、藿香青枯菌等12株菌株基因組DNA為對照，利用優(yōu)化好的PCR反應(yīng)方法進(jìn)行擴(kuò)增．根據(jù)電泳條帶的有無檢測生姜青枯菌引物的特異性，并且對陽性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析．試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)．

靈敏度檢測： 利用超微量紫外分光光度計(jì)測定青枯菌模版DNA純度及濃度，將模板濃度稀釋至10，1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6ng/μL共8個(gè)濃度梯度，使用優(yōu)化后的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相．試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)．

1.2.6 植株組織和土壤的病原菌檢測

田間采集具有典型生姜青枯病癥狀的病株及其根際土壤樣本(表1)，提取生姜病株組織和土壤基因組DNA后用建立的PCR方法進(jìn)行病原菌檢測．同時(shí)，對采集的樣本進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)鑒定，以驗(yàn)證該P(yáng)CR檢測方法的準(zhǔn)確性．試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)．

表1 發(fā)病植株和土壤樣本信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(p<0.05)，繪圖采用sigma plot軟件．

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜青枯病病原菌的分離

從采集具有典型青枯病癥狀的生姜植株(圖1a)中分離得到了10株培養(yǎng)性狀一致的菌株，菌落為圓形或梭形，菌體乳白色，表面光滑，略有隆起(圖1b)．選取3個(gè)典型菌株ES202021，ES202022和ES202023作為代表菌株進(jìn)行后續(xù)致病力測定．

圖1 生姜青枯病的發(fā)病癥狀及病原菌菌落形態(tài)

2.2 致病性測定

以活化1 d的ES202021，ES202022和ES202023菌懸液接種到培養(yǎng)60 d的健康生姜苗，以接種無菌水為空白對照，觀察并記錄生姜植株的發(fā)病情況．結(jié)果顯示，接種菌株后生姜葉片邊緣開始內(nèi)卷下垂、葉尖變成黃色，然后擴(kuò)展至整個(gè)葉片，導(dǎo)致葉片逐漸枯萎，最后整個(gè)植株死亡，這與所采集的生姜發(fā)病植株的發(fā)病癥狀表現(xiàn)一致，而對照植株完全不發(fā)病(圖2)．15 d后調(diào)查病情指數(shù)，結(jié)果顯示，接種菌株ES202021，ES202022和ES202023的生姜苗病情指數(shù)分別為35.2，34.1和38.2，平均病情指數(shù)超過30.0．3個(gè)菌株均具有強(qiáng)致病力，其中ES202023致病力最強(qiáng)，選取其為代表菌株進(jìn)行下一步的鑒定．分別收集接種菌株ES202023和無菌水培養(yǎng)5 d后的生姜植株組織，進(jìn)行重新分離純化鑒定，其試驗(yàn)結(jié)果表明，在接種菌株的生姜植株組織中分離純化獲得的病菌與接種菌株ES202023相同，而接種無菌水的空白對照組織樣本中沒有分離到接種病原菌，符合柯赫氏致病性驗(yàn)證法則．

圖2 生姜接種無菌水及病菌后的生長狀況

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

ES202023在培養(yǎng)基上單菌落為圓形或梭形，菌體乳白色，表面濕潤有光澤，流動性極強(qiáng)，生長到第3 d時(shí)，菌落中間出現(xiàn)粉紅色．革蘭氏染色結(jié)果顯示，該菌株為革蘭氏陰性菌(圖3a)．掃描電鏡結(jié)果顯示，菌體為單胞，呈短桿狀，大小為(0.5～0.7) μm× (1.5～2.0) μm(圖3b)．

圖3 生姜青枯病病原菌形態(tài)特征

2.4 分子生物學(xué)鑒定

以提取的病原菌基因組為模板，通過通用引物16S-F/16S-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增其16SrDNA序列，得到約1 400 bp的特異擴(kuò)增片段．將片段測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST對比，如表2所示，ES202023與已經(jīng)報(bào)道的青枯雷爾氏菌序列相似性為99.9%．下載相似度較高的多條序列、同屬序列和外群序列的16SrDNA序列，構(gòu)建菌株ES202023的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)．結(jié)果表明，菌株ES202023與多條青枯雷爾氏菌聚類在同一分支上．結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、致病性測定與分子生物學(xué)鑒定，證明菌株ES202023為青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)．

表2 菌株ES202023的16SrDNA序列NCBI比對結(jié)果

MEGA7.0軟件中鄰近距離法建樹，自舉數(shù)據(jù)集1 000次．圖4 ES202023 16S r RNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5 生理小種和生物型鑒定

菌株對不同寄主的致病性結(jié)果顯示，分離獲得的青枯雷爾氏菌ES202023對生姜和番茄具有強(qiáng)致病力，發(fā)病率為100%，對馬鈴薯具有弱致病力，發(fā)病率30%，不能感染茄子、煙草和辣椒．根據(jù)Hayward[25]的生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)，ES202023菌株屬于4號生理小種．菌株對碳源的利用結(jié)果顯示，分離獲得的青枯雷爾氏菌ES202023對麥芽糖、纖維二糖、乳糖、甘露醇、山梨醇和甜醇6種碳源的利用結(jié)果均呈陽性反應(yīng)，依據(jù)Hayward[25]的生物型劃分標(biāo)準(zhǔn)，ES202023菌株屬于生物型Ⅲ．

2.6 PCR檢測方法的建立及優(yōu)化

設(shè)計(jì)優(yōu)化退火溫度等條件，并應(yīng)用Alphalmaher TM 2200軟件對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在58～70 ℃的退火溫度下，引物21F/21R對生姜青枯菌DNA模板均可擴(kuò)增出單一條帶(圖5)．當(dāng)退火溫度為61.1 ℃時(shí)，相對PCR效率最高(圖6)．結(jié)合不同延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)的PCR擴(kuò)增檢測條件的試驗(yàn)結(jié)果，定PCR最優(yōu)反應(yīng)條件(總體積為 25 μL)為： 2×Taq Master PCR Mix 12.5 μL，引物21F/21R 0.5 μL，模板1 μL，補(bǔ)加dd H2O至25 μL．反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，61.1 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min．

圖6 PCR不同退火溫度條件下的PCR效率

2.7 PCR反應(yīng)特異性及靈敏度檢測

特異性檢測： 按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件，用引物21F/21R對不同種屬來源的菌株基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅生姜青枯菌基因組DNA能擴(kuò)增出1條125 bp的特異性條帶，而其他菌株及陰性對照均無擴(kuò)增條帶(圖7)．通過對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，擴(kuò)增出的特異性片段與青枯雷爾氏菌的同源性高達(dá)99%，因此，引物21F/21R能夠特異性地檢測青枯雷爾氏菌菌株．

M： DL 1000 DNA Marker；N： 空白對照；58.0～70.0單位均為℃．圖5 不同延伸溫度對引物21F/21R檢測青枯雷爾氏菌效果的影響

靈敏度檢測： 利用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件對8個(gè)不同濃度梯度的模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖8所示．隨模板DNA濃度的降低條帶亮度也在下降，引物21F/21R對供試菌株基因組的最低檢測濃度為10-2ng/μL．

圖8 PCR靈敏度檢測

2.8 發(fā)病植株和土壤的青枯病菌檢測

通過生姜青枯病特異性引物21F/21R對不同地區(qū)的病姜組織和土壤進(jìn)行檢測．結(jié)果顯示，20份從不同地區(qū)采集的病株組織中有2份病樣組織未檢測到目標(biāo)菌(圖9)．

M： DL 1000 DNA Marker；1： 青枯雷爾氏菌；2： 番茄青枯菌；3： 土豆青枯菌；4： 藿香青枯菌；5： 煙草青枯菌；6： 變黃假單胞菌；7： 臺灣假單胞菌；8： 谷關(guān)假單胞菌；9： 大黃魚致病性香魚假單胞菌；10： 胡蘿卜軟腐果膠桿菌： 11： 路氏腸桿菌；12： 蠟樣芽孢桿菌；13： 鮑曼不動桿菌；14： 成團(tuán)泛菌；15： 解鳥氨酸拉烏爾菌；16： 陰性對照(ddH2O)．圖7 病原菌PCR特異性檢測

土壤樣本中，20份從不同地區(qū)采集的病株根際土壤中有2份病樣組織未檢測到目標(biāo)菌，病菌檢出率為90%(圖10)．此外，通過常規(guī)方法對病樣組織和帶菌土壤進(jìn)行了病原菌分離培養(yǎng)和鑒定，其鑒定結(jié)果與PCR分子檢測結(jié)果相吻合，由此可見，此方法可以檢測感病生姜植株和土壤中的病原菌．

M： DL 1000 DNA Marker；1： 恩施宣恩病株組織；2： 恩施來鳳病株組織；3： 荊州馬山鎮(zhèn)病株組織；4： 荊州江陵病株組織；5： 荊州公安病株組織；6： 荊州松滋病株組織；7： 山東萊蕪病株組織；8： 山東濰坊病株組織；9： 山東安丘病株組織；10： 山東平度病株組織；11： 重慶江津病株組織；12： 重慶永川病株組織；13： 重慶榮昌病株組織；14： 重慶潼南病株組織；15： 四川南充病株組織；16： 四川開江病株組織；17： 四川綿陽病株組織；18： 四川樂山病株組織；19： 河南焦作病株組織；20： 河南上蔡病株組織；N： 陰性對照(ddH2O)．圖9 發(fā)病植株的PCR檢測

M： DL 1000 DNA Marker；1： 恩施宣恩根際土壤；2： 恩施來鳳根際土壤；3： 荊州馬山鎮(zhèn)根際土壤；4： 荊州江陵根際土壤；5： 荊州公安根際土壤；6： 荊州松滋根際土壤；7： 山東萊蕪根際土壤；8： 山東濰坊根際土壤；9： 山東安丘根際土壤；10： 山東平度根際土壤；11： 重慶江津根際土壤；12： 重慶永川根際土壤；13： 重慶榮昌根際土壤；14： 重慶潼南根際土壤；15： 四川南充根際土壤；16： 四川開江根際土壤；17： 四川綿陽根際土壤；18： 四川樂山根際土壤；19： 河南焦作根際土壤；20： 河南上蔡根際土壤；N： 陰性對照(ddH2O)．圖10 土壤病菌的PCR檢測

3 結(jié)論與討論

生姜因長期采用無性繁殖的方式重茬種植，導(dǎo)致多種土壤病原菌不斷積累，包括生姜青枯病在內(nèi)的重大土傳病害普遍發(fā)生，嚴(yán)重威脅廣大姜農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入[26]．盡管自20世紀(jì)60年代開始，陳莉等[9]、戢俊臣等[10]和趙志祥等[11]對不同地區(qū)生姜青枯病病原菌進(jìn)行了研究，但是有關(guān)湖北省內(nèi)的生姜青枯病病原菌的研究卻鮮有報(bào)道．本研究從湖北省恩施土家族苗族自治州的生姜青枯病病株中分離得到了菌株ES202023，經(jīng)致病性測定、形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)的鑒定，證明湖北恩施生姜青枯病的病原菌為青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)，與前人研究結(jié)果一致．

隨著病原菌檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR分子檢測技術(shù)已經(jīng)較為成熟，在植物病原菌的檢疫和田間預(yù)警中得到廣泛的應(yīng)用，為植物病害的有效防控提供了技術(shù)支持．在植物病原菌的快速分子檢測上，李華偉等[27]根據(jù)甘薯薯瘟病菌的特異基因(orf428)序列設(shè)計(jì)了重組酶聚合酶等擴(kuò)增(RPA)引物，建立了能夠快速檢測甘薯薯瘟病菌的RPA方法．李得銘等[28]對番茄青枯菌進(jìn)行分離，并通過篩選3對特異性引物，建立三重PCR，檢測番茄植株和土壤中的青枯菌．張麗芳等[29]以煙草青枯菌和其他2個(gè)煙草病原菌的基因組DNA為模板，分別設(shè)計(jì)3對特異性引物，建立了能同時(shí)檢測3種病害的多重PCR方法．以上研究表明，利用單一或多重的PCR技術(shù)方法能有效檢測病原菌的存在．本研究構(gòu)建的生姜青枯菌PCR快速分子檢測技術(shù)，其PCR快速檢測技術(shù)方法特異性強(qiáng)，能排除番茄青枯菌、土豆青枯菌、藿香青枯菌等不同生理小種的干擾．通過優(yōu)化檢測引物PCR反應(yīng)條件，靈敏度達(dá)到10-2ng/μL，可以滿足生姜生產(chǎn)中青枯菌檢測的需求．該方法不僅能檢測植株的帶菌情況，還可用于田間土壤青枯菌的檢測，有助于生姜青枯病田間早期預(yù)警檢測，為生姜青枯病的綠色防控提供科學(xué)依據(jù)．