薛 兵， 趙一霈， 成秀梅， 薛思思， 任威威， 楊彩瑞， 方惠敏， 王 迪

(河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合外科， 石家莊 050000)

痤瘡是一種發(fā)生于顏面、胸背等處的毛囊皮脂腺慢性炎癥性疾病，其發(fā)病與生殖激素失調(diào)、皮脂分泌增加、毛囊管角化過度以及炎癥反應(yīng)有關(guān)。研究表明，痤瘡的發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1]。痤瘡丙酸桿菌通過T0ll/NF-κB信號通路，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的合成和釋放，對痤瘡炎性因子具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。研究表明，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干擾素-γ(inter feron-γ,IFN-γ)在痤瘡炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[3]。T0ll/NF-κB信號通路可啟動TNF-α、IFN-γ參與炎癥反應(yīng)。本研究通過觀察大鼠局部炎癥反應(yīng)及TLR-2、 NF - κ B p65、TNF-α、IFN-γ的變化，探討清消法治療痤瘡的作用機理。本研究已通過河北中醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，編號DWLL2019011。

1 材料與方法

1.1 動物及藥物

清潔級wistar大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號SCXK(冀)2018-004。將40只wistar大鼠于河北中醫(yī)學(xué)院科研中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，溫度(24±2)℃，相對濕度50%～60%，自由飲食。

異維A酸軟膠囊(10 mg×20 s，上海信誼延安藥業(yè)，批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H10930210)；枇杷清肺飲加減方組成：枇杷葉9 g，桑白皮9 g，黃芩9 g，黃連6 g，梔子6 g，連翹9 g，金銀花 12 g，槐花9 g，山楂12 g，皂角刺6 g，赤芍9 g，浙貝母9 g，甘草3 g，為中藥顆粒制劑，購于河北中醫(yī)學(xué)院國醫(yī)堂，蒸餾水水浴溶解后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

痤瘡丙酸桿菌混懸液(ATCC6919)由廣東省微生物研究所提供，厭氧，4 ℃保存；IFN-γ ELISA試劑盒(貨號CSB-E04579r)，優(yōu)爾生生物；TNF-α ELISA 試劑盒(貨號88-7340)，賽默飛生物；DAB 顯色試劑盒(貨號PK-4001)，美國Vectorlabs；兔TLR-2多克隆抗體(貨號A11225)，武漢Abclonal公司；兔NF-κB P65多克隆抗體(貨號GB11142)、HRP標(biāo)記山羊抗兔(貨號GB23303)，賽維爾生物。

1.3 動物分組及給藥

將40只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、西藥組、中藥組。模型制備成功后，各組進行相應(yīng)的灌胃給藥，中藥組給予枇杷清肺飲加減方，西藥組給予異維A酸膠囊，參照人與動物等效劑量換算法(體表面積換算法)[4]。枇杷清肺飲加減方給藥濃度11.25 g·kg-1，灌胃給藥體積為10 mL·kg-1；異維A酸軟膠囊給藥濃度3.125 mg·kg-1，灌胃給藥體積為10 mL·kg-1；空白組和模型組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥21 d。

1.4 大鼠耳廓痤瘡模型制備及標(biāo)本收集

模型組、西藥組、中藥組大鼠右耳廓皮內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌混懸液(6×107cfu/mL)，每日1次，每次50 μl/200 g，連續(xù)注射5 d[5]。通過表觀指標(biāo)和病理指標(biāo)判斷模型的成功建立，表觀指標(biāo)變化是痤瘡最直接的判定標(biāo)準(zhǔn)，是判定大鼠痤瘡模型制備成功與否的核心指標(biāo)[6]。局部皮膚病理指標(biāo)是判定大鼠模型成功與否的直接證據(jù)[7]。模型建立后表觀指標(biāo)顯示，局部組織增厚、變硬、紅腫；局部皮膚隆起呈丘疹并出現(xiàn)膿皰；毛囊口出現(xiàn)黑色角栓并開放增大，毛囊面積及皮脂腺直徑變大。病理顯示，局部表皮增厚，角化過度，棘細胞層肥厚；表皮、真皮、皮下組織界限模糊；毛囊皮脂腺增大明顯，可見毛囊漏斗部充滿角化物質(zhì)并擴大成壺狀；真皮上層毛細血管擴張明顯，有炎性細胞浸潤[5]。

末次給藥后禁食不禁水24 h備皮，給予10%水合氯醛麻醉，分離腹主動脈后采血，室溫靜置待凝，低溫4 ℃離心15 min(3000 r/min)，取上清液待用。同時取大鼠耳組織病灶部位，去除血漬后部分存于-80 ℃冰箱，部分存于4%多聚甲醛溶液中備用。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 大鼠耳廓外觀及形態(tài) 給藥期間，肉眼觀察大鼠耳廓痤瘡模型的耳外觀及形態(tài)變化，游標(biāo)卡尺測量大鼠耳廓厚度，計算大鼠耳廓腫脹率:大鼠耳廓腫脹率=(注射后耳廓厚度-注射前耳廓厚度)/注射前耳廓厚度×100%。

1.5.2 大鼠耳廓組織病理改變 大鼠耳廓組織經(jīng)4 %多聚甲醛固定后脫水、透明、包埋后制成6 μm切片，進行蘇木素染色、氨水反藍、伊紅復(fù)染，最后光鏡(×200)下觀察各組大鼠耳廓組織的病理改變并拍攝照片。

1.5.3 大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量變化 將 ELISA 試劑盒、大鼠血清樣品置于室溫復(fù)溫，嚴(yán)格按照試劑盒說明書對TNF-α、IFN-γ 細胞因子含量進行檢測，均于波長450 nm處以空白對照孔調(diào)零后檢測OD值，并計算各組大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量。

1.5.4 免疫組化分析大鼠耳廓組織TLR-2、NF-κB P65表達 將石蠟切片脫蠟至水、孵育、PBS充分洗滌，抗原修復(fù)后TLR-2、NF-κB P65一抗抗體4 ℃孵育過夜，次日磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中充分洗滌，滴加HRP山羊抗兔抗體，室溫孵育50 min，切片滴加 DAB顯色液5 min左右，蘇木素復(fù)染3 min左右，自來水沖洗后透明、封片。于顯微鏡下觀察，每組隨機選取相同部位5個高倍視野(×400)，采用 Image J 1.8.0系統(tǒng)分析，并以積分光密度(IOD) 代表蛋白相對表達量。

1.5.5 Western blot分析大鼠耳廓組織TLR-2、NF-κB P65的表達 取大鼠耳廓組織，加入蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，低溫高速離心后提取耳廓組織全蛋白，用二喹啉酸(BCA) 法測定其濃度，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。配?0%聚丙烯酰胺凝膠，每孔蛋白上樣量6 μg，設(shè)置濃縮膠電壓90V，分離膠120V，電泳至溴酚藍跑出即可終止電泳，轉(zhuǎn)膜，設(shè)置恒壓25 V，時間30 min，5%的脫脂牛奶中封閉1 h，然后將膜放入一抗抗體TLR-2(1∶1000)、NF-ΚB p65(1∶1000)中，4 ℃孵育過夜，次日洗滌，放入HRP山羊抗兔抗體室溫下孵育1 h后顯影，使用Image J 1.8.0軟件進行圖像分析，并量化目標(biāo)條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠耳廓外觀形態(tài)變化

圖1示，空白組大鼠耳廓柔軟菲薄，顏色淡紅，透光度良好，毛細血管清晰，耳管開口處可見均勻分布的細小毛囊及毛發(fā)，無丘疹、膿皰、粉刺、角栓等皮損顯現(xiàn)；模型組大鼠耳廓變厚、粗糙、干燥，大鼠耳廓顏色暗紅，皮膚表面粗糙隆起，高低不平，兼有散在丘疹、膿皰，注射處真皮上層毛細血管擴張明顯；中藥組和西藥組與模型組比較，丘疹、脂栓、膿皰不同程度減少，毛細血管較清晰，毛囊口略縮小、平整。

圖1 各組大鼠耳廓變化比較

2.2 各組大鼠耳廓厚度及腫脹率變化

表1示，與空白組比較，模型組大鼠耳廓厚度及腫脹率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥組、中藥組的大鼠耳廓厚度和腫脹率均有所改善(P<0.05)，且中藥組改善程度優(yōu)于西藥組(P<0.05)。

表1 比較各組大鼠耳廓厚度及治療后腫脹率比較

2.3 各組大鼠耳廓組織病理改變

圖2示，空白組大鼠耳廓組織未見明顯異常，無炎性細胞，表皮各層界限清晰、完整；模型組大鼠耳廓可見毛囊上皮與表皮顆粒層均增厚，表皮過度角化，表皮、真皮、皮下組織界限模糊，相鄰毛囊擴張融合，毛囊口被角化物質(zhì)填堵延伸至皮脂腺，漏斗部呈壺狀擴大(黑色箭頭)，真皮層可見擴張的毛細血管，毛囊周圍炎癥細胞浸潤 ；西藥組表皮增厚緩解，毛囊口角化減輕，僅有少量炎性細胞浸潤；中藥組毛囊擴張程度明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，且角化層逐步恢復(fù)其完整性。

圖2 治療后各組大鼠耳廓組織病理變化比較(HE×200)

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量

表2示，與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α水平升高，IFN-γ水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥組、西藥組均有所改善，即TNF-α水平有所下降，IFN-γ水平有所升高(均P<0.05)；與西藥組比較，中藥組改善效果好于西藥組(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IFN-γ水平比較

2.5 大鼠耳廓組織TLR-2、NF-κB P65的表達

圖3示，與空白組比較，模型組大鼠耳廓組織TLR-2、NF-κB P65表達明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，中藥組、西藥組均有所改善，即TLR-2、NF-κB P65表達均有所減少(P<0.05)；與西藥組比較，中藥組改善效果稍好于西藥組，即中藥組NF-κB P65表達明顯少于西藥組(P<0.05)，TLR-2表達也少于西藥組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：與空白組比較：***P<0.001；與模型組比較：###P<0.001，##P<0.01；與西藥組比較：@P<0.05

2.6 各組大鼠耳廓組織TLR-2、NF-κB P65的蛋白表達

與空白組比較，模型組大鼠耳廓組織TLR-2、NF-κB P65表達明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，中藥組、西藥組均有所改善，即TLR-2、NF-κB P65表達均有所減少(P<0.05)；而與西藥組比較，中藥組的改善效果稍好于西藥組，即中藥組NF-κB P65表達明顯少于西藥組(P<0.05)，TLR-2表達也少于西藥組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：與空白組比較：***P<0.001；與模型組比較：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05；與西藥組比較：@P<0.05

3 討論

痤瘡是一種臨床常見且多發(fā)的損美性疾病，容易給患者帶來抑郁、焦慮等負性情緒，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[8]。痤瘡的發(fā)病機制復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為其發(fā)病與雄激素水平偏高、皮脂腺分泌旺盛、炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)[9]，其中炎癥反應(yīng)貫穿痤瘡發(fā)病始終。在痤瘡炎癥反應(yīng)過程中，痤瘡丙酸桿菌發(fā)揮著重要作用[10]。痤瘡丙酸桿菌通過TLRs依賴途徑誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的合成和釋放，其中TLR2 作為一種跨膜蛋白，能夠識別痤瘡丙酸桿菌細胞壁上的肽聚糖，啟動相應(yīng)的病原相關(guān)分子模式，活化下游的NF-κB，使其從細胞外轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，最終啟動細胞因子TNF-α、IFN-γ等參與炎癥反應(yīng)[11-12]。

本研究與空白組比較，模型組大鼠耳廓表現(xiàn)為粗糙、干燥，毛細血管擴張明顯；病理可見毛囊上皮與表皮顆粒層均增厚，毛囊口被角化物質(zhì)堵塞延伸至皮脂腺，漏斗部擴大呈壺狀，毛囊周圍炎癥細胞浸潤；血清中TNF-α升高，IFN-γ下降；耳廓組織中TLR-2和NF-κB的表達顯著增加，提示痤瘡模型組大鼠的耳廓皮膚出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。

中醫(yī)認為，痤瘡的病因病機為肺經(jīng)風(fēng)熱、脾胃積熱和肝膽濕熱，而外感熱邪和情志郁結(jié)化火也是誘發(fā)痤瘡發(fā)病的重要因素，火熱之毒作用于肌膚，循經(jīng)上擾于面，致面部氣血壅滯，外發(fā)為丘疹、結(jié)節(jié)、囊腫?！夺t(yī)學(xué)心悟·醫(yī)門八法》中指出：“消者，去其壅也。 [13]”《外科啟玄》曰：“消者滅也，滅其形癥也。 [14]”清消法使痤瘡表現(xiàn)在外的丘疹、結(jié)節(jié)、囊腫等得以消散，同時達到清其內(nèi)、絕其源的目的，對痤瘡起到標(biāo)本兼治的作用[15]。成秀梅經(jīng)過多年的中醫(yī)思辨及臨床實踐，根據(jù)痤瘡的病機特點，以清消立法，以枇杷清肺飲加減為方，在原方的基礎(chǔ)上去掉原方人參，加入金銀花、黃芩、梔子、連翹、山楂、皂角刺、赤芍、浙貝母。方中以枇杷葉、桑白皮、金銀花為君藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的作用；以黃柏、黃芩、黃連為臣藥，具有清熱解毒、瀉熱除煩的功效；以梔子、連翹、山楂、皂角刺、赤芍、浙貝母為佐藥，具有泄熱除濕、涼血活血、軟堅散結(jié)的作用，諸藥共奏清熱解毒、軟堅散結(jié)之效，療效頗佳。結(jié)果顯示，與模型組比較，枇杷清肺飲組大鼠耳廓均恢復(fù)變軟變薄，毛囊擴張亦減輕；病理染色顯示，表皮層變薄，毛囊周圍炎癥細胞浸潤程度降低；枇杷清肺飲加減方組大鼠血清IFN-γ明顯升高，TNF-α明顯降低，提示枇杷清肺飲加減方可能通過促進IFN-γ表達，抑制TNF-α 表達以調(diào)節(jié)對痤瘡的炎癥反應(yīng)。

為進一步探討枇杷清肺飲對痤瘡炎癥的改善作用，本研究進一步檢測了T0ll/NF-κB信號通路中TLR2、NF-κB P65的蛋白水平。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠耳廓組織TLR-2、NF-κB P65表達明顯增加；與模型組比較，中藥組、西藥組均有所改善，即TLR-2、NF-κB P65表達均有所減少，且中藥組的改善效果稍好于西藥組，提示枇杷清肺飲可能通過調(diào)節(jié)TLR-2/NF-κB來改善痤瘡的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，清消法通過調(diào)節(jié)TLR-2/ NF-κB影響TNF-α、IFN-γ表達水平，改善痤瘡炎癥反應(yīng)。然而對于闡明清消法對TLR-2/ NF-κB在痤瘡發(fā)病過程中的調(diào)節(jié)作用，還需要進一步的細胞學(xué)實驗研究，從而為痤瘡的預(yù)防和治療構(gòu)建理論基礎(chǔ)。