何忠國(guó)， 侯 俊， 王彩云， 肖 艷， 畢 寧

(1.畢節(jié)市林業(yè)科學(xué)研究所， 貴州 畢節(jié) 551700； 2.大方縣扶貧開(kāi)發(fā)辦公室， 貴州 畢節(jié) 551700；3.畢節(jié)市中藥研究所， 貴州 畢節(jié) 551700)

冬蓀，學(xué)名白鬼筆(Phallusimpudicus)，又稱無(wú)裙蓀、竹下菌、鬼筆菌、竹菌，隸屬鬼筆科、鬼筆屬，主要分布在四川、貴州、安徽、云南、廣東等省，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、口感松脆、味道鮮美，是著名的藥食兩用真菌[1-3]。冬蓀含鄰苯二甲酸二丁酯、多糖、紫蘇烯、異山梨醇、硫化氫、乙醛、α-吡咯烷酮、二氫查爾酮、苯基巴豆油醛、9, 12-十八碳二烯酸乙酯、甲醛、苯乙醛、麥甾醇、煙酰胺、甲基硫醇、丙酸、氨基酸、糖醛酸聚糖等多種成分，以子實(shí)體、菌托和菌柄入藥，具有活血、除濕、祛痛的功效，可用于抗凝血、治療風(fēng)濕、促進(jìn)傷口愈合、消水腫等[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，冬蓀還具有抗癌、抗氧化等活性[6]，有防病保健、提高機(jī)體免疫力的功效[7]。隨著冬蓀價(jià)值的發(fā)現(xiàn)及資源開(kāi)發(fā)利用，冬蓀已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

目前，冬蓀在畢節(jié)大方、百里杜鵑管理區(qū)等縣區(qū)已有較大面積的人工栽培，但由于栽培技術(shù)不規(guī)范，菌種混亂，導(dǎo)致冬蓀產(chǎn)量不穩(wěn)、質(zhì)量不高，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。目前，對(duì)冬蓀的研究報(bào)道主要集中于生物學(xué)特性及化學(xué)成分方面[7-10]，有關(guān)優(yōu)良菌種資源篩選的研究報(bào)道極少。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，許多農(nóng)戶通過(guò)采集冬蓀竹蛋在室內(nèi)分離后直接做成菌種用于生產(chǎn)，菌種質(zhì)量良莠不齊，導(dǎo)致冬蓀性狀各異、產(chǎn)量不穩(wěn)定。因此，針對(duì)冬蓀種植中出現(xiàn)的品種雜多，優(yōu)勢(shì)資源少等問(wèn)題，收集種植體量相對(duì)較大的冬蓀資源進(jìn)行研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分析、田間對(duì)比等方式篩選出品相好、品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高的冬蓀品種加以推廣，充分保障農(nóng)戶的收益，推動(dòng)冬蓀產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 冬蓀資源收集與初步評(píng)價(jià)

在畢節(jié)市大方縣、百里杜鵑管理區(qū)等地區(qū)采集冬蓀種植面積較大的各種冬蓀菌蕾及子實(shí)體，根據(jù)冬蓀子實(shí)體形狀及商品性狀將采集來(lái)的冬蓀分為大桿蜂窩型、中桿肉質(zhì)型、小桿精品型三類，每個(gè)資源采集40枚菌蕾，20株子實(shí)體，考察各類冬蓀資源的菌蕾大小、子實(shí)體顏色、子實(shí)體長(zhǎng)度、菌柄組織密度、子實(shí)體的折干率等性狀，對(duì)冬蓀資源進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，選擇性狀較佳的冬蓀菌蕾進(jìn)行分離，淘汰外觀性狀不好的冬蓀資源。

1.2 室內(nèi)分離培養(yǎng)

1.2.1培養(yǎng)基配制

以PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)采集到的冬蓀菌蕾、子實(shí)體。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂5～7 g、定容至1 L，pH自然。制成PDA試管，置于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃ 101 kPa的條件下滅菌25 min。試管移出傾斜放置在工作臺(tái)上，冷卻備用。

1.2.2外植體消毒

將挑選好的冬蓀菌蕾用流水沖洗干凈，于超凈工作臺(tái)中用75%酒精浸泡1.5 min，無(wú)菌水沖洗3遍，再用0.1%升汞消毒12 min，無(wú)菌水沖洗5遍，取出后用無(wú)菌吸水紙吸干菌蕾表面水分，備用。

1.2.3接 種

用解剖刀從菌蕾中間縱向切開(kāi)，取菌蕾中菌柄雛形的底部生長(zhǎng)點(diǎn)3～5 mm白色組織塊，轉(zhuǎn)接到試管培養(yǎng)基中，蓋上棉塞，每個(gè)冬蓀資源接種6支試管。

1.2.4培養(yǎng)、觀察、記錄

接種完成后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察試管中菌絲的長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)情況，做好記錄。

1.3 提 純

1.3.1培養(yǎng)基制備

將PDA培養(yǎng)基配好滅菌完成后，分裝于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。

1.3.2菌落培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，截取試管中3 mm長(zhǎng)的菌絲轉(zhuǎn)接到裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)接3個(gè)點(diǎn)，25 ℃下培養(yǎng)7 d，選留單菌落菌種。

1.3.3菌落篩選

經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出的單菌落需及時(shí)挑菌，選純正、健壯的單菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落接一支斜面，待試管種長(zhǎng)好后，再分別轉(zhuǎn)接入原種培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿菌袋，然后進(jìn)行栽培試驗(yàn)，反復(fù)比較各菌落的生產(chǎn)性能，擇優(yōu)留取。

1.4 原種培養(yǎng)

原種培養(yǎng)基：質(zhì)量比為90%木屑+10%麥麩，含水量為70%～80%。

將配好的原種培養(yǎng)料裝袋，經(jīng)121 ℃ 101 kPa滅菌40 min，冷卻后即可接種。每支試管接種轉(zhuǎn)接原種6袋。接種完成后置于25 ℃的恒溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直至菌絲長(zhǎng)滿整袋，備用。

1.5 田間栽培試驗(yàn)

將制成的原種用于田間栽培實(shí)驗(yàn)，觀察出菇情況，統(tǒng)計(jì)分析各資源的產(chǎn)量、質(zhì)量等。

1.5.1原材料準(zhǔn)備

菌穴規(guī)格每穴0.3 m2(寬50 cm，長(zhǎng)60 cm)，冬蓀原種每穴1袋，木材30 kg·m-2，箭竹0.5 kg·m-2，麥麩0.5 kg·m-2、白糖0.5 kg·m-2，遮蓋物適量。

1.5.2操作方法

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，對(duì)分離轉(zhuǎn)接得到的3個(gè)類型的冬蓀原種進(jìn)行田間栽培試驗(yàn)，每個(gè)品種試驗(yàn)9穴，穴與穴間隔2 m，避免造成菌絲混合。通過(guò)統(tǒng)計(jì)觀察形成的菌蕾數(shù)量，出菇性狀的一致性，單位面積產(chǎn)量等指標(biāo)，進(jìn)一步對(duì)所采集冬蓀資源進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2007、SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 冬蓀資源初步評(píng)價(jià)

觀察各冬蓀資源的菌蕾大小、子實(shí)體的顏色、長(zhǎng)度、菌柄組織密度和子實(shí)體折干率等農(nóng)藝性狀，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，詳見(jiàn)表1。

由表1可知，大桿冬蓀菌蕾均重225.80 g，菌蕾平均直徑7.38 cm，菌托均厚0.44 cm，菌柄均長(zhǎng)20.14 cm，鮮子實(shí)體均重49.5 g，平均92.4朵折干品500 g，折干率11.09%，該種冬蓀菌柄粗壯，菌蓋大(圖1)，干品冬蓀菌柄之間孔隙大、菌柄組織密度小，菌蓋表層網(wǎng)孔大，外觀性狀不佳；中桿冬蓀菌蕾均重192.80 g，菌蕾平均直徑6.54 cm，菌托均厚0.48 cm，菌柄均長(zhǎng)16.28 cm，鮮子實(shí)體均重45.34 g，平均120.8朵折干品500 g，折干率9.18%，此類冬蓀折干率比大桿冬蓀少1.91%，但其干品肉質(zhì)肥厚、口感好，外觀形狀佳，商品性價(jià)較高；小桿冬蓀菌蕾均重186.60 g，平均直徑7.14 cm，菌托均厚0.42 cm，菌柄均長(zhǎng)12.72 cm，鮮子實(shí)體均重32.74 g，平均174朵折干品500 g，折干率僅為8.83%，極顯著低于大桿蜂窩型冬蓀，此類冬蓀外觀形態(tài)較小，采收時(shí)耗費(fèi)人工，但因其口感好、外觀性狀優(yōu)良，仍有部分企業(yè)發(fā)展種植，將其做成精品。

圖1 3種冬蓀的形態(tài)特征

另外，觀察發(fā)現(xiàn)子實(shí)體較大、菌柄較長(zhǎng)的冬蓀，其菌蕾重量也相對(duì)較大(見(jiàn)表1)，其中大桿蜂窩型冬蓀菌蕾均重顯著高于小桿精品型，大桿蜂窩型與中桿肉質(zhì)型、中桿肉質(zhì)型與小桿精品型的菌蕾平均單重之間無(wú)顯著性差異；3種冬蓀的菌蕾直徑、菌托厚度無(wú)顯著性差異，暗示其對(duì)冬蓀外觀性狀及產(chǎn)量的影響不大。

表1 不同冬蓀農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)

2.2 冬蓀母種特性初篩分析

通過(guò)選擇大桿、中桿、小桿冬蓀成熟菌蕾進(jìn)行組織分離，在相同的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下觀察試管中各冬蓀菌絲的生長(zhǎng)情況，主要觀察內(nèi)容及結(jié)果如表2所示。

表2 不同冬蓀菌蕾組織分離培養(yǎng)情況

通過(guò)對(duì)分離的冬蓀菌蕾在試管中菌絲性狀及生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，三類菌種的萌發(fā)能力都較強(qiáng)，大桿蜂窩型冬蓀菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，其次是中桿肉質(zhì)型冬蓀、小桿精品型冬蓀；小桿精品型冬蓀的滿管時(shí)間短于中桿肉質(zhì)型，大桿蜂窩型冬蓀滿管所需時(shí)間最長(zhǎng)。三類菌種的菌絲均潔白無(wú)瑕，但大桿蜂窩型、小桿精品型冬蓀的菌絲粗壯，中桿肉質(zhì)型冬蓀菌絲細(xì)小，大桿、中桿冬蓀菌絲分支較多，小桿冬蓀菌絲分支稍遜。

2.3 轉(zhuǎn)接原種結(jié)果分析

將分離、純化后的大桿、中桿、小桿3個(gè)類型的冬蓀菌種下轉(zhuǎn)接到相同的原種培養(yǎng)料中培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)3個(gè)類型的菌種在培養(yǎng)袋中菌絲的長(zhǎng)勢(shì)及萌發(fā)性均較好，轉(zhuǎn)接20 d內(nèi)中桿冬蓀菌絲長(zhǎng)勢(shì)快于小桿和大桿冬蓀(見(jiàn)圖2)，但20 d后小桿冬蓀菌絲生長(zhǎng)加快。大桿、中桿、小桿菌種長(zhǎng)滿菌袋的時(shí)間分別為75、72、65 d，菌絲生長(zhǎng)速度正常，菌絲長(zhǎng)勢(shì)均較好，未出現(xiàn)菌絲萎縮現(xiàn)象。

圖2 不同類型冬蓀原種生長(zhǎng)情況

2.4 田間栽培試驗(yàn)

將大桿、中桿、小桿3個(gè)類型的冬蓀原種進(jìn)行田間栽培試驗(yàn)，觀察記錄各菌種的生長(zhǎng)情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見(jiàn)表3。

表3 冬蓀田間種植情況

由表3可知，3個(gè)類型冬蓀在相同的栽培條件下，菌絲生長(zhǎng)習(xí)性有所不同，原基形成的時(shí)間、菌蕾形成時(shí)間均有差異。原基形成時(shí)間在栽種后45～52 d之間，其中大桿蜂窩型冬蓀的原基形成時(shí)間短，與中桿肉質(zhì)型、小桿精品型冬蓀原基形成時(shí)間差異極顯著；菌蕾形成時(shí)間在栽種后72～78 d，其中大桿蜂窩型、小桿精品型冬蓀的菌蕾形成時(shí)間較短，與中桿肉質(zhì)型冬蓀菌蕾形成時(shí)間差異極顯著。單位面積菌蕾數(shù)量及單株冬蓀的重量直接關(guān)系到單位面積冬蓀的產(chǎn)量，單位面積內(nèi)3個(gè)類型的菌蕾數(shù)量不同，其中大桿蜂窩型冬蓀顯著低于中桿肉質(zhì)型冬蓀，極顯著低于小桿精品型冬蓀；大桿蜂窩型、中桿肉質(zhì)型、小桿精品型冬蓀之間的單朵均重差異極顯著。由于3種冬蓀的單位面積菌蕾數(shù)量及單重差異，導(dǎo)致3種冬蓀的折干率、單位面積鮮品產(chǎn)量、干品產(chǎn)量均不同，表現(xiàn)為大桿蜂窩型冬蓀單位面積鮮品產(chǎn)量顯著高于中桿肉質(zhì)型冬蓀，極顯著高于小桿精品型冬蓀，小桿精品型冬蓀的單位面積鮮品產(chǎn)量最低。大桿蜂窩型冬蓀的折干率顯著高于中桿肉質(zhì)型冬蓀，極顯著高于小桿精品型冬蓀，小桿精品型冬蓀的折干率最低，單位面積干品產(chǎn)量最低，且與大桿、中桿冬蓀差異極顯著。小桿精品型冬蓀的菇期極顯著長(zhǎng)于大桿蜂窩型冬蓀，顯著長(zhǎng)于中桿肉質(zhì)型冬蓀。

結(jié)合出菇特性、產(chǎn)量性狀分析，大桿蜂窩型冬蓀子實(shí)體均重、單位面積產(chǎn)量、折干率均高于其他兩種類型，但其商品性狀不好，中桿肉質(zhì)型冬蓀各方面表現(xiàn)都較好，小桿精品型冬蓀在本次試驗(yàn)中的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)不明顯。因此，在田間大面積種植時(shí)建議選擇中桿肉質(zhì)型冬蓀為宜。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

通過(guò)在畢節(jié)市冬蓀主栽區(qū)收集獲得120枚菌蕾、60株子實(shí)體，進(jìn)行外觀性狀考察、初步篩選、分離培養(yǎng)、純化、室內(nèi)初篩、原種轉(zhuǎn)接、田間栽培試驗(yàn)等，篩選出適宜畢節(jié)地區(qū)種植的中桿肉質(zhì)型冬蓀，該菌種外觀性狀表現(xiàn)良好，出菇性狀穩(wěn)定，產(chǎn)量較高，折干率較好，其次為大桿蜂窩型冬蓀，小桿精品型冬蓀表現(xiàn)較差。

3.2 討 論

衡量食用菌品種優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)是菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，大桿蜂窩型冬蓀菌絲萌發(fā)速度快，長(zhǎng)勢(shì)極強(qiáng)，在母種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度也較快，但是原種以及基質(zhì)料中的生長(zhǎng)速度并沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)，且產(chǎn)量及出菇性狀不穩(wěn)定；而菌絲生長(zhǎng)較快、滿瓶時(shí)間短的小桿精品型冬蓀菌種在田間栽培實(shí)驗(yàn)中其農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量表現(xiàn)并不好，說(shuō)明菌絲體生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)與產(chǎn)量性狀之間的相關(guān)性不明顯，不能用其預(yù)測(cè)產(chǎn)量，這與王振河等[11]、龔光祿等[12]、杜萍等[13]的研究結(jié)果相一致。另外，也反映出母種培養(yǎng)基上菌絲表現(xiàn)良好的菌種在原種、栽培種以及田間栽培種不一定能長(zhǎng)勢(shì)良好，因此也不能用母種菌絲的長(zhǎng)勢(shì)來(lái)推測(cè)原種、栽培種的長(zhǎng)勢(shì)。

冬蓀等藥食兩用真菌的品種選育不僅要考慮產(chǎn)量、外觀形狀、產(chǎn)值，也要綜合考慮化學(xué)成分以及藥效、藥用價(jià)值等。因此在下一步系統(tǒng)選育中，將深入研究各種冬蓀的維生素、黃酮、多糖等化學(xué)成分含量，評(píng)估其藥用價(jià)值，建立多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)體系，從而系統(tǒng)評(píng)價(jià)各冬蓀菌種。