蘭金旭， 郭曉凱， 練從龍， 王鍇樂(lè)， 陳隨清

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

枸橘為蕓香科植物枳Poncirustrifoliate(L.)Raf.的干燥未成熟果實(shí)。性溫，味苦、辛，無(wú)毒；具有舒肝止痛、破氣散結(jié)、消食化滯、除痰鎮(zhèn)咳的功效，中醫(yī)臨床常用于理氣。唐宋以前作枳實(shí)用[1-3]，現(xiàn)代僅福建、廣東等地作枳殼和枳實(shí)用[4]。1991年版《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》稱其為豫香櫞，含有黃酮、香豆素、生物堿、揮發(fā)油等成分[5-7]，其中柚皮苷和新橙皮苷可促進(jìn)小鼠小腸推進(jìn)[8]，枳屬苷可抗炎[9]、抗幽門螺旋桿菌[10]和保護(hù)胃黏膜[11]。枸橘在全國(guó)大部分地方都有栽培，但果實(shí)多廢棄，造成了資源浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)枸橘進(jìn)行了生藥學(xué)研究，以期為藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料

BX53型正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；SP-30E型全自動(dòng)薄層色譜點(diǎn)樣儀(北京市永光明醫(yī)療器械有限公司)；沃特世e2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)。甲醇、磷酸、乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；雙蒸水(實(shí)驗(yàn)室制備)。新橙皮苷、柚皮苷(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-18040707和MUST-18050808)。藥材收集于河南、甘肅、安徽等地，共16批，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定為蕓香科植物枳Poncirustrifoliata(L.)Raf.的干燥果實(shí)。具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 呈圓形厚片狀，直徑2～4 cm。外果皮棕黃色至褐色，有顆粒狀突起，突起的頂端有凹點(diǎn)狀油室，果梗痕明顯。切面中果皮黃白色，光滑而稍隆起，厚0.1～0.5 cm，具有5～10瓣瓤瓣；內(nèi)含多數(shù)種子，種子黃白色，長(zhǎng)0.5～1.0 cm；質(zhì)堅(jiān)硬，氣清香，微苦，酸，澀，見(jiàn)圖1。不同產(chǎn)地性狀略有差別，貴州安順、廣西桂林藥材外果皮顏色呈棕褐色或褐色，顏色較深；山西晉城、甘肅文縣、云南富民藥材外果皮顏色呈黃棕色；河南禹州、安徽鳳陽(yáng)藥材外果皮呈棕黃色；安徽亳州藥材外果皮顏色兼有棕黃色和棕褐色；陜西西鄉(xiāng)藥材外果皮顏色兼有棕褐色和黃棕色。中果皮顏色以黃白色為主，僅貴州安順2批為黃褐色。種子大小差別較小。

圖1 枸橘藥材性狀鑒別圖(甘肅文縣)

2.2 顯微鑒別 粉末黃白色或棕黃色。取少量粉末制成水合氯醛透化片，可觀察到瓤囊細(xì)胞類圓形，細(xì)胞中多含草酸鈣晶體；氣孔環(huán)式，類圓形，副衛(wèi)細(xì)胞5～9個(gè)；非腺毛單細(xì)胞，長(zhǎng)100～300 μm，壁厚，光滑，基部稍彎曲；草酸鈣方晶成行排列，散在晶體較多；導(dǎo)管多為螺紋，網(wǎng)紋。見(jiàn)圖2。

1.瓤囊細(xì)胞 2.氣孔 3.非腺毛 4.草酸鈣結(jié)晶 5.導(dǎo)管圖2 枸橘藥材顯微鑒別圖

2.3 薄層鑒別 藥材粉末加入80%乙醇(1∶10)60 ℃水浴提取40 min，放冷補(bǔ)足減失質(zhì)量后過(guò)濾蒸干，殘?jiān)尤?0%乙醇溶解作為供試品溶液[12]。另取柚皮苷、新橙皮苷加入80%乙醇制備成0.5 mg/mL對(duì)照品溶液。取柚皮苷溶液、各樣品溶液2 μL點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)為展開(kāi)劑，晾干后噴灑10%三氯化鋁乙醇溶液，置于365 nm紫外燈下檢視。取新橙皮苷溶液、各樣品溶液2 μL點(diǎn)在同一聚酰胺膜薄層板上，以氯仿-甲醇-丙酮(15∶3.5∶1.5)為展開(kāi)劑，晾干后噴灑10%三氯化鋁乙醇溶液，置于365 nm紫外燈下檢視[13]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)薄層色譜上柚皮苷斑點(diǎn)、新橙皮苷斑點(diǎn)明顯，供試品色譜與對(duì)照品色譜位置相同，所有點(diǎn)均能完全分開(kāi)，見(jiàn)圖3～4。

1.柚皮苷對(duì)照品 2.貴州安順(第1批) 3.山西晉城 4.河南禹州 5.安徽亳州(第1批) 6.甘肅文縣(第1批) 7.陜西西鄉(xiāng)(第1批) 8.貴州安順(第2批) 9.陜西西鄉(xiāng)(第2批) 10.安徽亳州(第2批) 11.甘肅文縣(第2批) 12.云南富民 13.貴州安順(第3批) 14.安徽亳州 15.安徽鳳陽(yáng) 16.廣西桂林 17.安徽亳州(第3批)圖3 柚皮苷TLC色譜圖

1.貴州安順(第1批) 2.山西晉城 3.河南禹州 4.安徽亳州(第1批) 5.甘肅文縣(第1批) 6.陜西西鄉(xiāng)(第1批) 7.貴州安順(第2批) 8.陜西西鄉(xiāng)(第2批) 9.安徽亳州(第2批) 10.甘肅文縣(第2批) 11.云南富民 12.貴州安順(第3批) 13.安徽亳州 14.安徽鳳陽(yáng) 15.廣西桂林 16.安徽亳州(第3批) 17.新橙皮苷對(duì)照品圖4 新橙皮苷TLC色譜圖

2.4 水分、灰分、浸出物檢查 參考2015年版《中國(guó)藥典》[14]四部中通則0832烘干法、通則2302、通則2201項(xiàng)熱浸法進(jìn)行水分、灰分和浸出物測(cè)定，16批不同產(chǎn)地枸橘藥材含水量8.52%～12.12%，平均值10.81%；總灰分含量3.37%～6.02%，平均值4.10%；浸出物含量12.59%～16.84%，平均值14.80%。見(jiàn)表2。

表2 水分、總灰分、浸出物、各成分含量測(cè)定結(jié)果(%)

2.5 樣品含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸(20∶80)；檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 用甲醇溶解新橙皮苷、柚皮苷對(duì)照品，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得(柚皮苷、新橙皮苷質(zhì)量濃度分別為385、306 mg/mL)。

2.5.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末，加入甲醇(1∶25)，75 ℃水浴回流1.5 h，放冷，補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)，精密量取濾液10 mL，置于25 mL量瓶中定容，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取0.038 5、0.077 0、0.115 5、0.154 0、0.192 5 mg/mL柚皮苷對(duì)照品溶液各10 μL，以其色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=2×106X+54 834(r=0.999 6)。

精密吸取0.030 6、0.061 2、0.091 8、0.122 4、0.153 0 mg/mL新橙皮苷對(duì)照品溶液各10 μL，以其色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=279.36X-2 010.3(r=0.999 1)。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一藥材粉末2.0 g，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.5.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣10 μL，各測(cè)定6次，測(cè)得柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為1.29%、2.62%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 精密度試驗(yàn) 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)得柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為0.51%、0.50%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一藥材粉末6份，每份2.0 g，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為1.54%、2.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一藥材粉末6份(含柚皮苷3.23%、新橙皮苷1.65%)，每份2.0 g，加入100%水平對(duì)照品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5.9 樣品含量測(cè)定 16批藥材中柚皮苷含量為3.61%～7.60%，平均值為4.8%，其中2批低于4%，10批為4%～5%，3批為5%～6%，僅有1批高于6%；新橙皮苷含量為1.28%～2.31%，平均值為1.79%，其中3批超過(guò)2%，13批為1.28%～1.97%。

3 討論

枸橘作為地方藥材使用廣泛，尚未建立明確質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究可為枸橘鑒別和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂建立提供參考。