宋翌琰 陳潔 酈芳華 李若男 趙靜 郁大偉 宋華峰 徐俊馳 吳敏娟 胥萍

2019年全球近50萬人罹患利福平耐藥結(jié)核病，其中78%為耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)。目前，臨床上治療結(jié)核病主要使用抗結(jié)核藥物，科學合理地用藥對減少結(jié)核病的傳播和流行至關重要，對于減少結(jié)核病的耐藥意義重大[1-3]。為分析多次治療對患者耐藥性產(chǎn)生的影響，本研究收集了蘇州大學附屬傳染病醫(yī)院2013—2020年間反復多次治療且治療時間間隔≥2年的44例結(jié)核病患者的資料和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結(jié)果，分析結(jié)核病患者基線和反復多次治療后的結(jié)核分枝桿菌耐藥性，以期為臨床研究提供理論參考。

資料和方法

一、資料收集

收集蘇州大學附屬傳染病醫(yī)院在2013年1月至2020年12月間反復多次(治療次數(shù)≥2次)治療，且初次治療和最后一次治療時間間隔≥2年的44例結(jié)核病患者的資料和藥敏試驗結(jié)果?；颊呔鶠榻Y(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，均進行了藥敏試驗。

二、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)

1.標本前處理：(1)痰液：挑取約5 ml痰液至已標記的50 ml離心試管中，加等量4%氫氧化鈉(NaOH)處理液(去污染)；振蕩20 min。加無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS；pH值為6.8)至約45 ml，蓋緊蓋子；以離心半徑30 cm，3500 r/min離心15 min；倒掉上清液添加1～2 ml PBS(pH值為6.8)重懸。(2)體液(包括腦脊液、腹腔積液、胸腔積液)：無菌體液可直接接種，標本量>10 ml，以離心半徑30 cm，3000 r/min離心15 min，取沉淀物接種；污染標本須同痰液處理方法處理后再接種。(3)組織：用玻璃珠將組織均勻碾碎；取碾磨液至已標記的50 ml離心試管內(nèi)，加等量的4% NaOH前處理液，振蕩20 min，加無菌PBS(pH值為6.8)至約45 ml，蓋緊蓋子；以離心半徑30 cm，3500 r/min離心15 min；倒掉上清液添加1 ml PBS(pH值為6.8)重懸。

2.液體培養(yǎng)法：用OADC[由oleic(亞油酸)、albumin(白蛋白)、dextrose(葡萄糖)、catalase(過氧化氫酶)組成]直接溶解PANTA[由polymixin B(多黏菌素B)、amphotericin B(兩性霉素B)、nalidixic acide(奈啶酸)、trimethoprin(甲氧芐氨嘧啶)、azocillin(阿洛西林)組成]，在BBL MGIT培養(yǎng)管中加入0.8 ml混合添加劑，然后接種0.5 ml標本至BBL MGIT培養(yǎng)管中。液體培養(yǎng)基系統(tǒng)每日自動記錄熒光信號的變化，從而判定有無分枝桿菌生長。42 d內(nèi)系統(tǒng)顯示陽性，挑取菌液做結(jié)核抗原檢測，同時繼續(xù)做藥敏試驗；如果結(jié)核抗原檢測為陰性，則挑取菌液涂片做抗酸染色，如果涂片陽性繼續(xù)做藥敏試驗；42 d后系統(tǒng)顯示陰性，涂片抗酸染色如也為陰性，則結(jié)果為“培養(yǎng)42 d，未培養(yǎng)出分枝桿菌”。

3.藥敏試驗：采用羅氏比例法進行藥敏試驗。具體操作為：吸取液體培養(yǎng)管中的培養(yǎng)基，充分研磨后，與標準比濁管制成1 mg/ml的菌懸液，稀釋100倍制成0.01 mg/ml的菌懸液，再稀釋100倍制成10-4mg/ml的菌懸液，用標準接種環(huán)分別蘸取1滿環(huán)0.01 mg/ml的菌懸液和10-4mg/ml的菌懸液，用劃線法均勻接種于對照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基表面。35 ℃～37 ℃培養(yǎng)至少4周報告結(jié)果。

三、指標定義

任一耐藥：對任意一種及以上抗結(jié)核藥品(利福平、異煙肼、阿米卡星、乙胺丁醇、莫西沙星、左氧氟沙星、對氨基水楊酸、丙硫異煙胺和鏈霉素)耐藥；耐多藥(MDR)：至少同時對異煙肼和利福平耐藥；準廣泛耐藥(pre-XDR)：在MDR的基礎上耐莫西沙星或左氧氟沙星；基線耐藥：患者初次治療時痰液或纖維支氣管鏡洗液標本經(jīng)羅氏比例法培養(yǎng)，結(jié)果為耐藥；經(jīng)治耐藥：患者經(jīng)反復多次治療后的痰液或纖維支氣管鏡洗液標本經(jīng)羅氏比例法培養(yǎng)，結(jié)果為耐藥；轉(zhuǎn)化耐藥：患者初次治療時的痰液或纖維支氣管鏡洗液標本經(jīng)羅氏比例法培養(yǎng)時結(jié)果為敏感，經(jīng)過反復多次治療后結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)槟退?；恢復敏感：患者初次治療時的痰液或纖維支氣管鏡洗液標本經(jīng)羅氏比例法培養(yǎng)時結(jié)果為耐藥，經(jīng)過反復多次治療后結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾小３醮沃委熼_始至最后一次治療開始的平均時間間隔=從收到患者的第一份結(jié)核培養(yǎng)標本至末次治療收到第一份結(jié)核培養(yǎng)標本的時間間隔的合計時間/患者例數(shù)。

四、統(tǒng)計學處理

采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以“例數(shù)”和“百分率(%)”表示，采用χ2檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、一般情況

44例患者中，男性40例(90.9%)，女性4例(9.1%)；初次治療時的年齡范圍為20～86歲，平均年齡(50.3±18.3)歲；20～30歲10例(22.7%)，31～59歲13例(29.6%)，60～83歲21例(47.7%)；初次治療開始至最后一次治療開始的平均時間間隔為(39.3±10.7)個月，其中治療間隔24～36個月20例，37～48個月15例，49～60個月6例，61～72個月3例；治療2次28例，3次13例，4次3例。

二、結(jié)核病患者耐藥情況分析

44例患者中，經(jīng)反復多次治療后，患者感染的結(jié)核分枝桿菌全敏感菌株減少，任一耐藥、耐多藥、準廣泛耐藥、任意4種藥品耐藥、任意5種藥品耐藥、任意6種藥品耐藥和任意7種藥品耐藥率均出現(xiàn)增加。其中，準廣泛耐藥率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 44例結(jié)核病患者反復多次治療后結(jié)核分枝桿菌耐藥變化情況[例(耐藥率，%)]

基線時期，44例患者利福平耐藥率為20.5%，異煙肼耐藥率為31.8%，阿米卡星耐藥率為22.7%，左氧氟沙星耐藥率為7.9%，對氨基水楊酸耐藥率為5.4%，鏈霉素耐藥率為3.1%；無乙胺丁醇、莫西沙星和丙硫異煙胺耐藥菌株(表2)；經(jīng)反復多次治療后，部分患者的痰液或纖維支氣管鏡洗液標本由敏感轉(zhuǎn)變?yōu)槟退帲渲欣Ｆ睫D(zhuǎn)為耐藥9例(20.5%)，異煙肼轉(zhuǎn)為耐藥7例(15.9%)，阿米卡星轉(zhuǎn)為耐藥6例(13.6%)，乙胺丁醇轉(zhuǎn)為耐藥7例(15.9%)，莫西沙星轉(zhuǎn)為耐藥5例(12.8%)，左氧氟沙星轉(zhuǎn)為耐藥3例(7.9%)，對氨基水楊酸轉(zhuǎn)為耐藥2例(5.4%)，丙硫異煙胺轉(zhuǎn)為耐藥7例(18.4%)，鏈霉素轉(zhuǎn)為耐藥1例(3.1%)；但也有部分患者由耐藥轉(zhuǎn)為敏感，其中利福平恢復敏感1例(2.3%)，異煙肼2例(4.5%)，阿米卡星7例(15.9%)，乙胺丁醇1例(2.3%)，對氨基水楊酸1例(2.7%)。見表2。

表2 44例反復多次治療結(jié)核病患者治療前后結(jié)核分枝桿菌耐藥對比情況

與基線菌株比較，經(jīng)反復多次治療后，乙胺丁醇、莫西沙星和丙硫異煙胺耐藥率差異有統(tǒng)計學意義，利福平、異煙肼、阿米卡星、左氧氟沙星、對氨基水楊酸和鏈霉素耐藥率差異無統(tǒng)計學意義。17例(38.6%)結(jié)核病患者耐受藥品的種類發(fā)生增多現(xiàn)象，其中增多1種8例(18.2%)，增多2種4例(9.1%)，增多3種2例(4.5%)，增多4種2例(4.5%)，增多8種1例(2.3%)。

討 論

盡管全球結(jié)核病的負擔在下降，但距離實現(xiàn)終止結(jié)核病的目標存在一定的困難。阻礙這一目標實現(xiàn)的原因之一即為耐藥結(jié)核病，耐藥結(jié)核病也是臨床上關注的重點。患者感染耐藥結(jié)核分枝桿菌的主要原因有：初次感染時，感染的結(jié)核分枝桿菌即為耐藥菌；或初次感染時為敏感菌，經(jīng)過長期用藥后，結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)長期進化，轉(zhuǎn)化為耐藥結(jié)核分枝桿菌[4-5]。我國MDR-TB治愈率較低。Chen等[6]回顧性分析了2014年1月至2016年9月浙江省某結(jié)核病定點醫(yī)院經(jīng)過標準治療的所有MDR-TB患者，共納入治療失敗患者20例和治療成功患者74例，發(fā)現(xiàn)18例(90.0%)治療失敗的患者以原發(fā)菌株持續(xù)感染為特征，其中14例(77.8%)在治療無效的情況下發(fā)生了表型或基因型獲得性耐藥。治療失敗患者有效藥物數(shù)量不超過3種，聯(lián)合治療方案中有效藥物數(shù)量不足是MDR-TB治療失敗的主要原因。所以，臨床上應密切關注結(jié)核分枝桿菌的耐藥問題。

本研究回顧性分析了2013年1月至2020年12月期間蘇州大學附屬傳染病醫(yī)院反復多次治療且治療時間間隔≥2年的結(jié)核病患者的資料。藥敏試驗結(jié)果顯示：乙胺丁醇、莫西沙星和丙硫異煙胺耐藥率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義。44例患者中，17例患者出現(xiàn)了耐受藥物種類增多的現(xiàn)象，5例轉(zhuǎn)變?yōu)闇蕪V泛耐藥結(jié)核病。出現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌對藥物的耐藥率增高和耐藥種類的增多可能與結(jié)核病的治療史有關，用藥不規(guī)范、自行停藥、中斷治療等均會導致結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥，隨著抗結(jié)核治療時間的延長，結(jié)核分枝桿菌發(fā)生耐藥的概率也會升高。雖然本研究中部分藥物的藥敏試驗存在缺失，數(shù)據(jù)可能存在一定偏倚，但是仍可以作為參考，在一定程度上反映耐藥率的變化情況。

本研究納入的患者出現(xiàn)多次治療的原因較多，主要為體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌復燃和外源性結(jié)核分枝桿菌再感染。一般認為，治療后結(jié)核病患者耐藥性的產(chǎn)生是由于治療不當導致的獲得性耐藥。也有研究表明，由傳播引起的耐藥也占據(jù)一定比例。Nsofor等[7]對2009—2015年上海市收治肺結(jié)核患者的首株和末株結(jié)核分枝桿菌進行基因型和全基因組測序，發(fā)現(xiàn)外源性再感染引起的原發(fā)性耐藥是上海地區(qū)結(jié)核病患者產(chǎn)生耐藥的主要原因。此外，Shen等[8]對2000—2012年期間上海地區(qū)所有經(jīng)細菌學確診的成功治療的復發(fā)或再感染結(jié)核病患者進行了回顧性隊列研究。研究發(fā)現(xiàn)，5.3%(710/13 417)的成功治療患者出現(xiàn)復發(fā)，每1000人年7.55次(95%CI：7.01～8.13)，是普通人群肺結(jié)核發(fā)病率的18倍以上；在141例有配對分離株的復發(fā)患者中，59例(41.8%)有不同的基因型，表明再次感染了不同的菌株。所以，本研究中44例患者出現(xiàn)了多次治療史的具體原因還要在未來的研究中進一步分析。

綜上所述，在結(jié)核病的治療過程中，應密切關注結(jié)核分枝桿菌的耐藥問題，合理規(guī)范用藥，有效治療結(jié)核病，并且采取合適的預防和阻斷傳播措施，以減少耐藥結(jié)核病的流行。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明宋翌琰：論文撰寫、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學分析；酈芳華、李若男、陳潔：數(shù)據(jù)整理；趙靜、郁大偉、宋華峰：藥物敏感性試驗；徐俊馳、吳敏娟：研究指導；胥萍：研究指導、論文修改。