王曉雯，楊姍姍，奚 瑋，徐 慧

（青島市食品藥品檢驗研究院，山東青島 266071）

檸檬烯是天然物質(zhì)，具有無毒特性，經(jīng)FDA批準(zhǔn)可以食用，F(xiàn)AO和WHO對檸檬烯的ADI（每日允許攝入量）也不作限量規(guī)定。檸檬烯具有多種生理活性和生物功效，有殺蟲、抑菌、抗菌消炎和抗腫瘤的功效。檸檬烯是一種單萜類化合物，具有抗氧化活性，在氧氣和光照環(huán)境中不穩(wěn)定，易氧化，快速、高效的提取方法是提高提取率的關(guān)鍵。本實驗以檸檬烯得率為評價指標(biāo)，通過單因素正交試驗確定提取橘子皮中檸檬烯的最佳閃式提取條件[1-6]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890型氣相色譜儀，帶火焰離子化檢測器；閃式提取儀，無錫廣蘊生化科技有限公司；高速離心機，美國Tomas公司；渦漩混合器，金壇市億通電子有限公司；均質(zhì)器，德國IKA公司；固相萃取裝置，Supelco公司；石墨化碳黑固相萃取SPE小柱（6 mL，500 mg），Supelco公司。

1.2 提取影響因素分析

影響提取效率的因素主要有提取溶劑種類、料液比、提取時間、提取次數(shù)等，本研究在固定其他因素的前提下，以檸檬烯得率為評價指標(biāo)進行研究，分析以上單因素工藝條件對檸檬烯得率的影響，采用正交設(shè)計優(yōu)化最佳工藝條件。

1.3 實驗方法

（1）橘子皮中檸檬烯提取的實驗室工藝流程。干橘子皮→粉碎→閃式提取→離心→石墨化；碳黑固相萃取SPE小柱凈化→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無正己烷→正己烷溶解殘渣定容至10 mL，氣相色譜測定。

（2）檸檬烯得率的測定。檸檬烯得率（%）=c×v/m×100%，其中c-提取液中檸檬烯濃度（g/mL），v-定容體積（mL），m- 試樣質(zhì)量（g）。

（3）氣相色譜儀器條件。色譜柱：DB-1柱30 m×0.32 mm×1.0 μm；柱箱溫度：100 ℃（2 min）以 10 ℃/min的速度升至200 ℃，保持10 min；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：250 ℃；載氣：高純氮氣，1 mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比10∶1；進樣量：1 μL；檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=1.016 33C-0.172 5，r=0.998 9，A為吸光度，C為檸檬烯的含量，據(jù)此計算橘子皮中檸檬烯的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑的選擇

稱取6份粉碎的橘子皮樣品各2.000 g（每份之間誤差不超過5%）置于100 mL閃式提取器中，分別加入10 mL乙醇、丙酮、甲醇、正己烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚和6號溶劑油作為溶劑，提取1次，提取時間為1 min，進行閃式提取。提取液按1.3（1）步驟處理，按1.3（3）的氣相色譜條件測定，計算檸檬烯得率，每組實驗重復(fù)3次，取平均值。提取溶劑對檸檬烯得率的影響如圖1所示。結(jié)果表明，提取溶劑為正己烷時，得率達(dá)到最大值。因為檸檬烯類物質(zhì)是脂溶性強的物質(zhì)，在烴類、醚類溶劑中溶解效果較好，醇類溶劑提取效率低一些。

圖1 提取溶劑種類對檸檬烯得率的影響

2.1.2 料液比的確定

稱取6份粉碎的橘子皮樣品各2.000 g（每份之間誤差不超過5%），置于100 mL閃式提取器中，分別加入體積為2 mL、5 mL、10 mL、15 mL和20 mL的正己烷作為溶劑，提取1次，提取時間為1 min。提取液1.3（1）步驟處理，按1.3（3）的氣相色譜條件測定，每組實驗重復(fù)3次，計算檸檬烯得率，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，檸檬烯的提取效率隨著正己烷添加量即料液比的增加而逐漸增加，正己烷添加量為10 mL，即料液比1∶5后趨于平緩。

圖2 料液比對檸檬烯得率的影響

2.1.3 提取時間的確定

準(zhǔn)確稱取6份粉碎的橘子皮樣品各2.000 g（每份之間誤差不超過5%），置于100 mL閃式提取器中，加入10 mL正己烷作溶劑，提取1次，分別控制提取時間0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min和3.0 min進行閃式提取。提取液按1.3（1）步驟處理，按1.3（3）的氣相色譜條件測定，計算檸檬烯得率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時間對檸檬烯得率的影響

結(jié)果表明，1 min以前，隨著提取時間增加，得率增大，1 min之后，得率隨時間的延長不再增加，可能由于隨著時間的延長，提取過程產(chǎn)生熱量，導(dǎo)致少量的檸檬烯揮發(fā)，并且檸檬烯受熱更易于氧化，導(dǎo)致得率反而會微弱下降。

2.1.4 提取次數(shù)的確定

準(zhǔn)確稱取6份粉碎的橘子皮樣品各2.000 g（每份之間誤差不超過5%），置于100 mL閃式提取器中，加入10 mL正己烷作為溶劑，提取時間為1 min，分別提取1、2、3、4、5及6次。提取液按1.3（1）步驟處理，按1.3（3）的氣相色譜條件測定，計算得率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取次數(shù)對檸檬烯得率的影響

結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，檸檬烯的得率逐漸增大且趨于平緩。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗設(shè)計和結(jié)果

為獲得橘子皮中檸檬烯的最佳提取工藝條件，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，正己烷作為提取溶劑，以檸檬烯含量為考察目標(biāo)，選取影響橘子皮中檸檬烯提取效率的料液比、提取時間、提取次數(shù)，設(shè)計3因素3水平正交試驗，每個實驗條件做3次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。正交水平因素設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 正交水平因素設(shè)計

表2 正交試驗結(jié)果與分析

由表2可知，極差RA＞RC ＞RB，因此影響因素料液比＞提取次數(shù)＞提取時間。最佳條件為：A3B3C3，即最佳提取條件為：提取溶劑正己烷，料液比1 ∶ 10（g/mL），提取時間 1.5 min，提取 3 次。

2.2.2 提取工藝驗證

按以上最佳工藝條件，用橘子皮樣品 2.000 g，重復(fù)實驗 6 次，檸檬烯得率分別為 2.15%、2.14%、2.11%、2.12%、2.15% 和2.09%，平均值為 2.13%，RSD為 1.14%，證明工藝是可行的。

2.3 結(jié)論

本實驗通過正交試驗得出橘子皮中檸檬烯的最優(yōu)提取條件為提取溶劑正己烷，料液比1∶10（g/mL），提取時間1.5 min，提取3次，平均得率為2.13%，RSD為1.14%，建立了一種簡單、高效的檸檬烯提取工藝條件。