聶甜 江勁波 何婭娜 楊琳 周欣欣 郝敬全 劉凱 寧彩虹

〔摘要〕 目的 探討牛角地黃湯對(duì)免疫性血小板減少癥（ITP）大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。方法 將36只SD大鼠用兔抗SD大鼠血小板血清法建立ITP大鼠模型后隨機(jī)分成模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)空白組，每組12只。于造模第7天，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組分別予牛角地黃湯、地塞米松干預(yù)，模型組和空白組給予等體積的生理鹽水干預(yù)。4周后處死各組大鼠，用RT-PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO、JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO蛋白表達(dá)量。結(jié)果 與空白組比較，模型組ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO蛋白和IDO、JKA1、STAT1 mRNA表達(dá)水平均降低（P<0.05）。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO、JAK1、STAT1 mRNA和IDO蛋白表達(dá)均增高（P<0.05）。結(jié)論 牛角地黃湯可能通過JAK1/STAT1信號(hào)分子促進(jìn)ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO表達(dá)，減少血小板免疫性損傷。

〔關(guān)鍵詞〕 免疫性血小板減少癥;外周血單個(gè)核細(xì)胞;牛角地黃湯;吲哚胺2，3-雙加氧酶;JAK1;SATA1

〔中圖分類號(hào)〕R255.9? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.004

Effects of Niujiao Dihuang Decoction on IDO Expression in Peripheral Blood

Mononuclear Cells of Immune Thrombocytopenia Rats

NIE Tian， JIANG Jingbo*， HE Yana， YANG Lin， ZHOU Xinxin， HAO Jingquan， LIU Kai， NING Caihong

（The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha ，Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect and possible mechanism of Niujiao Dihuang Decoction on indoleamine 2， 3-dioxygenase （IDO） expression in peripheral blood mononuclear cells of immune thrombocytopenia （ITP） rats. Methods ITP rat model was established by rabbit anti SD rat platelet serum method in 36 SD rats， and were randomly divided into model group， positive control group and experimental group， with a blank group， 12 rats in each group. On the 7th day of modeling， rats in the experimental group and positive control group were respectively given Niujiao Dihuang Decoction and dexamethasone intervention， and rats in the model group and blank group were given the same volume of normal saline intervention. Rats in each group were sacrificed 4 weeks later. The mRNA expression levels of IDO， JAK1， STAT1 in peripheral blood mononuclear cells were detected by RT-PCR， and the protein expression level of IDO in peripheral blood mononuclear cells was detected by Western blot. Results Compared with blank group， IDO protein and mRNA expression levels of IDO， JKA1 and STAT1 in peripheral blood mononuclear cells of ITP rats in model group were decreased （P<0.05）. Compared with model group， the mRNA expression levels of IDO， JAK1， STAT1 and IDO protein expression in peripheral blood mononuclear cells of ITP rats in experimental group and positive control group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion Niujiao Dihuang Decoction may promote the expression of IDO in peripheral blood mononuclear cells of ITP rats through JAK1/STAT1 signaling molecule and reduce platelet immune injury.

〔Keywords〕 immune thrombocytopenia; peripheral blood mononuclear cells; Niujiao Dihuang Decoction; indoleamine 2，3-dioxygenase; JAK1; STAT1

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是免疫異常介導(dǎo)的血小板破壞和產(chǎn)生不足的常見出血性疾病[1]。細(xì)胞免疫功能紊亂，尤其是特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)血小板的破壞是ITP發(fā)病的重要機(jī)制[2。研究[3]表明，免疫調(diào)節(jié)酶吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase， IDO）可以誘導(dǎo)血小板特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞凋亡，從而減少ITP血小板免疫性破壞。JAK激酶和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and activator of transcription， STAT）是許多調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究[4]發(fā)現(xiàn)，肝炎或自身免疫性疾病患者JAK/STAT信號(hào)通路失活導(dǎo)致調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞IDO表達(dá)減少，進(jìn)而影響到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化，這可能導(dǎo)致血小板特異性T細(xì)胞加速對(duì)自身血小板的免疫性破壞。

ITP的中醫(yī)病名為“紫癜病”，病理性質(zhì)表現(xiàn)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛涉及氣、血、肝、脾、腎，以腎虛為主，在本虛的基礎(chǔ)上容易外感熱毒、火邪等，導(dǎo)致血液溢出脈外，形成紫癜[5]。本課題組在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)牛角地黃湯能有效改善ITP患者出血體質(zhì)，40例ITP患者的治療總有效率高達(dá)82.5%[6]。為進(jìn)一步明確該方的藥效機(jī)制，本課題組主要采用分子生物學(xué)技術(shù)研究牛角地黃湯對(duì)ITP大鼠模型外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO mRNA和蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步從JAK1/STAT1信號(hào)分子探討牛角地黃湯干預(yù)ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO表達(dá)的作用機(jī)制，旨在為ITP的中醫(yī)藥治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，鼠齡6～8周，體質(zhì)量130～170 g。室溫18～20 ℃，濕度為68%～70%，自由進(jìn)食飲水。

1.2? 主要藥品與試劑

牛角地黃湯藥物組成為：水牛角30 g，生地黃24 g，赤芍12 g，牡丹皮9 g，淫羊藿15 g，巴戟天15 g，鎖陽(yáng)15 g，甘草10 g。上述中藥飲片均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑中心提供，按《中華人民共和國(guó)藥典》[7]要求進(jìn)行鑒定和質(zhì)量控制。牛角地黃湯由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室用韓國(guó)東華DHJ-02煎藥機(jī)制備，所有藥物均先用冷水浸泡30 min，其中水牛角先煎30 min，再將其他藥物放入后煎煮30 min，真空包裝，200 mL/袋，拆開包裝后倒入蒸發(fā)皿中濃縮，濃縮劑含生藥0.6 g/mL。

醋酸地塞米松片（遂成藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：2003201）;抗大鼠IDO1抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab106134）;β-actin內(nèi)參抗體（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)：66009-1-Ig）;BCA蛋白測(cè)定試劑盒（北京Beyotime公司，批號(hào)：P0012S）;鼠外周血淋巴分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：LTS1077）;蛋白磷酸酶抑制劑（蘇州新賽美生物科技有限公司，批號(hào)：P001）;RIPA細(xì)胞裂解液（北京Solarbio公司，批號(hào)：R0020）;TBST緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：T1080）;超敏發(fā)光液（美國(guó)advansta公司，批號(hào)：K-12045-D50）;Trizol（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：15596026）;mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：CW2569）。

1.3? 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量RCP儀（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：PIKOREAL96）;垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-2C）;臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）;水平瓊脂糖電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCP-31DN）;生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：BioPrep-24）;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)（上海天能生物科技有限公司，型號(hào)：Tanon5200）。

2 方法

2.1? 動(dòng)物分組與處理

36只SD大鼠參照文獻(xiàn)[8]制備兔抗SD大鼠血小板血清，建立ITP大鼠模型，造模后血小板低于100×109/L，而白細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)均正常為造模成功。造模后采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，另取12只正常SD大鼠為空白組。各組大鼠造模后第7天灌胃給藥（均按常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的體表面積比值表折算成大鼠等效灌胃劑量[9]），實(shí)驗(yàn)組ITP大鼠每次灌胃1 mL（0.6 g/mL），1次/d，模型組ITP大鼠和空白組大鼠給予等體積的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃4周。陽(yáng)性對(duì)照組ITP大鼠參照成人ITP診治指南[10]給予一線大劑量地塞米松連續(xù)沖擊干預(yù)，每次灌胃1 mL（0.9 mg/mL），1次/d，連續(xù)灌胃4 d。

2.2? 標(biāo)本采集與制備

各組大鼠采用0.3 mL/100 g的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血3 mL，EDTA抗凝。

2.3? 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1? Western blot檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO蛋白含量? 提取細(xì)胞蛋白：用冰預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞1次，收集懸液，離心半徑11 cm，3 000 r/min離心3 min，加入200 μL RIPA裂解液，離心半徑11 cm，12 000 r/min離心15 min。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫下脫色，搖床上封閉2 h。加入IDO一抗，4 ℃孵育過夜。傾去一抗，用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的雜交袋中，加入羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。使用超敏發(fā)光液與膜孵育1 min，用塑封膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X射線攝影膠片曝光15 min，顯影沖洗。

2.3.2? RT-PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO、JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)? Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，Trizol提取細(xì)胞總RNA。RNA逆轉(zhuǎn)錄：取RNA提取物8 μL加入1 μL 18堿基Oligo，混勻離心后65 ℃溫浴10 min。冷卻的反應(yīng)液依次加入以下試劑：dNTP Mix 4 μL、RNA引物2 μL、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶7 μL、緩沖液4 μL、RNA酶抑制劑2 μL、基因組DNA清除劑2 μL，42 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min。逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行熒光定量PCR（引物序列見表1，反應(yīng)體系見表2，PCR程序設(shè)定參數(shù)見表3）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析：結(jié)果采用2-ΔCt法，計(jì)算目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。-△Ct=目的基因的△Ct-內(nèi)參基因的△Ct。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用“x±s”表示，所有資料進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)性和方差齊，兩兩比較用t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析，反之則采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

與空白組相比，模型組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO mRNA和蛋白表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白組和陽(yáng)性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4、圖1。

3.2? 各組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞JAK1、STAT1mRNA表達(dá)水平比較

與空白組相比，模型組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白組和陽(yáng)性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表5。

4 討論

ITP是一種自身抗血小板抗體和（或）自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)血小板破壞和產(chǎn)生不足導(dǎo)致的自身免疫性疾病，以孤立的血小板減少為特征[11]。脾臟巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞將自身血小板膜糖蛋白（尤其是GPIIb/IIIa、GPIb/IX）提呈給CD4+ T細(xì)胞，活化后的CD4+ T細(xì)胞表達(dá)CD40L與B淋巴細(xì)胞CD40相結(jié)合誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗血小板抗體，而CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞則可以通過細(xì)胞毒作用加速自身血小板的破壞[12]。中醫(yī)學(xué)無ITP病名，既往根據(jù)臨床癥狀特點(diǎn)歸為“葡萄疫”“發(fā)斑”等范疇，第七屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合血液病學(xué)術(shù)會(huì)議將ITP中醫(yī)病名確定為“紫癜病”[13-14]。紫癜病的病理性質(zhì)主要表現(xiàn)為虛實(shí)錯(cuò)雜，急性期以邪實(shí)為主，慢性期以正虛為主，重癥患者多表現(xiàn)為虛實(shí)并重[15]。本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為ITP病機(jī)以腎虛為本，熱毒為標(biāo)，腎虛導(dǎo)致髓血不充，血小板生成障礙，亦可因虛外感熱邪或引發(fā)伏毒，迫血妄行。治療上本課題組強(qiáng)調(diào)溫清并用，以牛角地黃湯為組方，本方以水牛角和淫羊藿為君藥，水牛角苦寒，清熱解毒、涼血止血，淫羊藿益腎補(bǔ)陽(yáng)，此即如王冰所言：“益火之源，以消陰翳”[16]。生地黃和巴戟天為臣藥，生地黃甘寒質(zhì)潤(rùn)，補(bǔ)血益陰，助牛角涼血止血，巴戟天歸腎經(jīng)，補(bǔ)助元陽(yáng)，益精，下氣降火。赤芍、牡丹皮清熱涼血、活血散瘀，鎖陽(yáng)補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血，甘草調(diào)和諸藥，共為佐使之劑。

色氨酸是免疫微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞賴以增殖的必需氨基酸，而IDO是色氨酸通過腎素途徑降解的初始和限速酶，通過加速色氨酸分解導(dǎo)致犬尿氨酸等代謝物積累，阻止T細(xì)胞的增殖和阻斷T細(xì)胞的效應(yīng)活性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO mRNA和蛋白表達(dá)均低于空白組大鼠（P<0.05）。WANG C Y等[18]研究表明，ITP患者CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞IDO表達(dá)顯著低于正常健康人，無法通過色氨酸分解代謝途徑維持ITP免疫耐受。由此可見，IDO作為免疫調(diào)節(jié)分子，在ITP細(xì)胞免疫異常導(dǎo)致血小板免疫性破壞中扮演了重要角色，提示IDO表達(dá)減少可能是ITP細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)的重要機(jī)制。

自身反應(yīng)性CD4+ T淋巴細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)血小板的免疫性損傷是ITP的主要發(fā)病機(jī)制[19]。西醫(yī)常采用環(huán)孢素、長(zhǎng)春新堿等免疫抑制劑干預(yù)ITP使其恢復(fù)自身免疫耐受平衡，然而臨床療效不佳，究其原因主要是上述免疫抑制劑并沒有從源頭促進(jìn)ITP恢復(fù)免疫耐受，僅僅是抑制CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量和活性[20]。本課題研究結(jié)果表明，牛角地黃湯干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組ITP大鼠較模型組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO mRNA和蛋白表達(dá)顯著增多（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO mRNA和蛋白表達(dá)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明牛角地黃湯可能通過增加外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO表達(dá)促使ITP大鼠恢復(fù)自身免疫耐受，減少血小板免疫損傷，而IDO有望成為中醫(yī)藥干預(yù)ITP異常免疫的潛在干預(yù)靶標(biāo)。高云龍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，服用中藥紫癜靈合劑后，治療有效組患者的IDO在外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)明顯升高。紫癜靈和牛角地黃湯均含有水牛角、生地黃、牡丹皮，存在共同的基礎(chǔ)方——犀角地黃湯（水牛角易犀角），進(jìn)一步表明清熱涼血法可能是促進(jìn)ITP外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO表達(dá)增強(qiáng)的重要中醫(yī)治法，使患者已受損的免疫功能得到一定程度的恢復(fù)和改善。

針對(duì)影響IDO表達(dá)的上游機(jī)制，文獻(xiàn)研究證實(shí)，JAK/STAT信號(hào)通路活化與IDO表達(dá)密切相關(guān)，但與ITP發(fā)生發(fā)展的相關(guān)報(bào)道較少[22]。XU Y M等[23]在287個(gè)ITP基因表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)了155個(gè)JAK/STAT異常信號(hào)分子，說明JAK/STAT信號(hào)通路參與了ITP的發(fā)病，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步探索。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)下降（P<0.05），且模型組大鼠IDO mRNA和蛋白表達(dá)減少（P<0.05），這證明JAK1/STAT1表達(dá)減少參與了ITP大鼠的發(fā)病，潛在的機(jī)制可能是JAK1/STAT1表達(dá)減少影響了ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞免疫紊亂。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)牛角地黃湯干預(yù)后外周血單個(gè)核細(xì)胞JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)水平增高（P<0.05），且模型組大鼠IDO mRNA和蛋白表達(dá)增多，這證實(shí)牛角地黃湯可能促進(jìn)JAK1、STAT1表達(dá)，進(jìn)一步影響ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO表達(dá)，減少血小板免疫性損傷。本實(shí)驗(yàn)基于JAK1/STAT1信號(hào)分子對(duì)牛角地黃湯改善ITP大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IDO表達(dá)做了創(chuàng)新性探討，但仍需進(jìn)一步設(shè)計(jì)臨床研究、優(yōu)化基礎(chǔ)研究，從多視角探討牛角地黃湯干預(yù)ITP的作用機(jī)制。

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