立 新，奧·烏力吉，那仁滿都拉

1.內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 通遼 028000

2.內蒙古民族大學附屬醫(yī)院，內蒙古 通遼 028000

3.內蒙古蒙醫(yī)藥工程技術研究院，內蒙古 通遼 028000

4.浙江大學醫(yī)學院，浙江 杭州 310000

發(fā)熱是指當機體體溫中樞功能障礙或受到致熱源侵襲時，體溫升高超過正常范圍的現(xiàn)象，是人體常見的一種癥狀。在體溫調節(jié)中樞作用下，正常成年人機體的產(chǎn)熱和散熱處于動態(tài)平衡，而嬰幼兒體溫調節(jié)功能尚未完全發(fā)育成熟，在受到致熱源侵襲時容易引起發(fā)熱癥狀[1]。因此，發(fā)熱是兒科最常見病癥之一。在一定限度內的發(fā)熱是機體抵抗疾病的生理性保護機制，可增強機體抗感染能力，若長期處于超高熱狀態(tài)，不僅使機體免疫功能下降，同時也對各組織、臟器造成損害，尤其易誘發(fā)嬰幼兒驚厥等病癥，甚至會產(chǎn)生器官衰竭等不可逆轉的危害，威脅嬰幼兒生命安全[2]。

蒙藥三臣丸出自《四部醫(yī)典》[3]，又名圖喜木勒-3，由天竺黃、紅花和牛黃3味中藥組成，具有清熱、解毒、止咳、鎮(zhèn)驚的功效。三臣丸組方性涼，臨床上主要用于治療兒童肺熱、肝熱、驚悸等癥[4-5]。由于具有良好的解熱功效，三臣丸在蒙醫(yī)臨床中常作為小兒發(fā)熱的首選藥[6-8]。從現(xiàn)代研究的處方成分分析，三臣丸中的3味藥材均具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的功效，可提高機體免疫功能，對多數(shù)的發(fā)熱均具有解熱、抗炎作用[9-10]。目前該制劑有散劑和水丸2種劑型[11]，但均不便于患兒服用，患者依從性較差，影響藥物療效。本研究將三臣丸改進為兒童易于接受的凝膠貼膏劑，采用干酵母致大鼠發(fā)熱模型評價三臣小兒退熱貼膏的解熱作用；同時采用代謝組學技術，通過檢測血漿代謝物探究三臣小兒退熱貼膏對干酵母致大鼠發(fā)熱模型的解熱機制，以期為臨床治療小兒發(fā)熱提供新的外用藥物。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠，6周齡，體質量（200±20）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物許可證號SCXK（遼）2015-0001。大鼠分籠飼養(yǎng)，6只/籠，室溫（25±2）℃、濕度（65±10）%，通風及光照條件良好，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)內蒙古民族大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準號NM-LL-2020-05-10-01）。

1.2 藥材

紅花（產(chǎn)地為新疆，批號20201105）購自安徽中美堂中藥飲片有限公司，天竺黃（產(chǎn)地為云南，批號20201105）購自安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司，人工牛黃（批號201002）購自四川費德力制藥有限公司，經(jīng)內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院蒙藥教研室布和巴特爾教授鑒定，紅花為菊科植物紅花Carhamus tinctoriusL.的干燥花，天竺黃為禾本科植物青皮竹Bambusa textilisMcClure桿內的分泌液干燥后的塊狀物，人工牛黃為由牛膽粉、膽酸、去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成。

1.3 藥品與試劑

活性干酵母粉（批號20200106W）購自安琪酵母股份有限公司；氯化鈉注射液（批號20191203）購自山東華魯制藥有限公司；硫化鈉（批號20180901）購自山東西亞化學工業(yè)有限公司；阿司匹林腸溶片（100 mg/片，批號BJ50742）購自德國Bayer公司；甘油（批號20200715）購自遼寧泉瑞試劑有限公司；聚丙烯酸鈉（批號20P46NF110）購自上海冠英生物科技有限公司；酒石酸（批號20180623）購自天津天力化學試劑有限公司；氮酮（批號07969700408）購自臨沂市綠森化工有限公司；LC-MS級乙腈、甲醇購自德國CNW Technologies GmbH公司；LC-MS級乙酸銨購自美國Sigma公司；LC-MS級氨水購自美國Fisher Chemical公司；超純水購自屈臣氏。

1.4 儀器

Vanquish超高效液相色譜儀、QExactive HFX高分辨質譜儀、Heraeus Fresco 17型離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BSA124S-CW型天平（德國Sartorius公司）；PS-60AL型超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司）；HZ85-2型磁力攪拌器（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；DT580型實驗室涂布機（北京信義惠達機電設備有限公司）；寵物用電推剪（深圳科德士電器有限公司）；電子體溫計[歐姆龍（大連）有限公司]。

2 方法

2.1 三臣小兒退熱貼膏的制備

藥物處方藥為等比例的紅花、人工牛黃、天竺黃，基質處方為聚丙烯酸鈉、甘羥鋁、酒石酸、氮酮、甘油、水、藥粉（6∶0.20∶0.15∶2∶30∶48∶10）。

制備方法如下：取處方量紅花，加入15倍量60%乙醇，浸泡提取3次，60 min/次，合并提取液；回收乙醇，50 ℃減壓濃縮成浸膏，備用。人工牛黃和天竺黃粉碎至過150目篩，備用。將聚丙烯酸鈉和甘羥鋁加入盛有甘油的燒杯中，充分攪勻后加入處方量人工牛黃、天竺黃藥粉和氮酮，用攪拌器混合均勻作為A相；酒石酸溶于純化水，加入紅花提取浸膏后用攪拌器攪拌均勻作為B相；將B相緩慢加入A相中，攪拌至充分交聯(lián)后，涂布于無紡布上，蓋上保護膜，室溫下放置干燥。同法制備空白基質貼膏。

2.2 分組、造模與給藥

大鼠于實驗環(huán)境中每日測量肛溫2次，使其適應3 d，實驗前12 h禁食不禁水，用電動剃毛器為大鼠腹部相應部位剃毛，以8%硫化鈉脫毛，脫毛面積為5 cm×5 cm。實驗當日每小時測量體溫1次，連續(xù)3次，3次體溫的平均值作為基礎體溫，剔除1次體溫＞38 ℃及溫度變化＞0.3 ℃的大鼠[12]。

將符合要求的大鼠按基礎體溫隨機分為對照組、模型組、阿司匹林（100 mg/kg）組以及三臣小兒退熱貼膏高、中、低劑量（16、8、4 mg/kg，以羥基紅花色素含量計）組和空白基質貼膏組，每組8只。模型組和各給藥組大鼠背部sc酵母（10 mL/kg）[13]，對照組背部sc等體積氯化鈉注射液。造模后第4小時，阿司匹林組ig藥物，三臣小兒退熱貼膏組和空白基質膏組腹部脫毛部位分別貼相應貼膏，用實驗用大鼠貼劑固定帶加以固定。造模第7小時，各給藥組再給予相應的受試藥物。從造模開始，每小時測量肛溫1次，連續(xù)10次。

2.3 樣品的采集與制備

最后1次測完體溫后，大鼠ip 3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，取血后大鼠脫頸椎處死。對照組、模型組和三臣小兒退熱貼膏高劑量組取血于肝素鈉管中，3000 r/min離心10 min，取上清液，于 -80 ℃保存，用于后續(xù)超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-QE-MS）分析。

取50 μL樣品，加入200 μL含同位素標記內標混合物的提取液[甲醇-乙腈（1∶1）]，渦旋混勻30 s，于冰水浴超聲10 min，-40 ℃靜置1 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液上機檢測。所有樣品另取等量上清液混合成質控樣品上機檢測[14]。

2.4 色譜和質譜條件

2.4.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH Amide色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水的水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～0.5 min，95% B；

0.5～7.0 min，95%～65% B；7.0～8.0 min，65%～40% B；8.0～9.0 min，40% B；9.0～9.1 min，40%～95% B；9.1～12.0 min，95% B；體積流量為0.5 mL/min；柱溫為30 ℃；樣品盤溫度為4 ℃；進樣體積為2 μL。

2.4.2 質譜條件 鞘氣流量體積為30 arb；輔助氣流量體積為25 arb；毛細管溫度為350 ℃；全質譜分辨率為60 000；MS/MS分辨率為7500；碰撞能量為10、30、60 eV；噴霧電壓為3.6 kV/-3.2 kV；掃描范圍m/z70～1050。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析

2.5.1 體溫反應曲線的繪制 計算各組大鼠體溫變化，以時間為橫坐標、體溫變化為縱坐標，繪制體溫反應曲線。

體溫變化＝測得體溫－基礎體溫

2.5.2 體溫反應指數(shù)的計算 縱坐標按0.4 ℃對應1 cm，橫坐標按1 h對應l cm的比例，計算造模后4～10 h體溫反應曲線與基線之間的面積，共計5個梯形的面積，數(shù)值越低，表明解熱效果越好。

2.5.3 代謝組學數(shù)據(jù)處理 質譜儀采集的數(shù)據(jù)為“raw”格式，通過格式轉換軟件MSconvert將原始數(shù)據(jù)轉化成“mzXML”格式，將數(shù)據(jù)進行R語言xc-ms軟件包預處理[15-16]，包括峰匹配、峰對齊、濾噪、保留時間校正，最終獲得1個三維數(shù)據(jù)矩陣（含保留時間、峰強度、質荷比信息），將三維矩陣信息以“csv”格式導入在線數(shù)據(jù)分析軟件，導入SIMCA-P13.0進行多元統(tǒng)計分析，包括無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）[17]和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）[18]，篩選出投影變量重要性（variable importance in projection，VIP）＞1的變量，將其以“xls”格式導入MassProfiler Professional軟件中分析，篩選P＜0.01的變量，作為生物標志物。根據(jù)獲得的潛在標志物的精確相對分子質量檢索HMDB、METLIN、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和MetaboAnalyst 3.0等數(shù)據(jù)庫[19-20]，參考相關文獻及質譜信息鑒定生物標志物，通過比對一級質譜信息得到的精確相對分子質量并結合結構碎片信息，通過查找文獻與在線數(shù)據(jù)庫比對，對篩選出來的差異化學成分進行鑒定和通路分析。

2.5.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)均用±s表示，采用SPSS 17.0軟件分析，兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 三臣小兒退熱貼膏對干酵母致發(fā)熱大鼠體溫的影響

表1 各組大鼠造模后各時間點的體溫 ( ±s,n = 8)Table 1 Body temperature of rats in each group at various time point after modeling ( ±s,n = 8)

表1 各組大鼠造模后各時間點的體溫 ( ±s,n = 8)Table 1 Body temperature of rats in each group at various time point after modeling ( ±s,n = 8)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01；與阿司匹林組比較：△P＜0.05 **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs model group; △P < 0.05 vs aspirin group

組別 劑量/ (mg·kg-1) 體溫/℃ 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h 造模后7 h 造模后8 h 造模后9 h 造模后10 h 對照 — 0.09±0.15 0.03±0.14 0.09±0.15 0.10±0.17 0.06±0.14 0.08±0.08 0.04±0.12 模型 — 0.81±0.15** 1.10±0.12** 1.60±0.17** 1.82±0.19** 1.63±0.18** 1.55±0.14** 1.41±0.15** 阿司匹林 100 0.83±0.14 0.99±0.13 0.69±0.15## 0.65±0.09## 0.34±0.11## 0.20±0.13## 0.13±0.10## 三臣小兒退熱貼膏 16 0.84±0.01 0.83±0.12##△ 0.88±0.17##△ 0.68±0.15## 0.55±0.13##△ 0.38±0.14##△ 0.26±0.05##△ 8 0.84±0.17 0.85±0.13## 0.90±0.12##△ 0.83±0.10##△ 0.71±0.15##△ 0.58±0.11##△ 0.41±0.11##△ 4 0.83±0.16 0.88±0.13## 1.05±0.07##△ 1.10±0.14##△ 0.90±0.12##△ 0.86±0.14##△ 0.83±0.12##△ 空白基質貼膏 — 0.81±0.13 0.80±0.12##△ 1.02±0.13##△ 1.20±0.12##△ 0.80±0.13##△ 1.01±0.08##△ 0.65±0.05##△

如表1和圖1所示，與對照組比較，造模后4 h模型組大鼠體溫顯著升高（P＜0.01），表明造模成功。造模后4 h各給藥組給予受試藥物，如表2所示，與模型組比較，各給藥組大鼠體溫反應指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與阿司匹林組比較，三臣小兒退熱貼膏低劑量組和空白基質貼膏組體溫反應指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與空白基質貼膏組比較，三臣小兒退熱貼膏中、高劑量組和阿司匹林組大鼠體溫反應指數(shù)顯著降低（P＜0.05、0.01），表明三臣小兒退熱貼膏能夠降低干酵母致發(fā)熱大鼠的體溫，且呈劑量相關性，其中高劑量三臣小兒退熱貼膏作用最強，退熱作用平穩(wěn)；空白基質貼膏也有一定的物理降溫作用，但是其解熱作用不持久且不穩(wěn)定。

表2 各組大鼠造模后4～10 h的體溫反應指數(shù)Table 2 Body temperature response index of rats in each group of 4—10 h after modeling

圖1 各組大鼠的體溫反應曲線 ( ±s,n = 8)Fig.1 Body temperature response curve of rats in each group ( ±s,n = 8)

3.2 多元統(tǒng)計分析

3.2.1 血漿代謝輪廓分析 通過UPLC-QE- Exactive分析各組大鼠血漿代謝物，如圖2所示，正、負離子模式下，各組大鼠血漿代謝物總離子流圖峰高與保留時間有一定差異，表明各組大鼠代謝模式存在差異。

3.2.2 質譜模式分析 將獲得的檢測數(shù)據(jù)矩陣進行數(shù)據(jù)預處理和PCA分析，如圖3-A所示，正、負離子模式下，質控樣本明顯聚集在一起，且集中分布于95%可信區(qū)間內，表明儀器和數(shù)據(jù)質量可靠。為觀察各組的分組聚類效果，將標準化后的數(shù)據(jù)進行PCA分析，再做有監(jiān)督的OPLS-DA模式識別，得到OPLS-DA二維得分圖（圖3-B、C），對照組與模型組、模型組與高劑量三臣小兒退熱貼膏組樣本明顯分開，表明樣本呈現(xiàn)出良好的分類效果。

圖2 正離子 (A)、負離子 (B) 模式下各組大鼠血漿總離子流圖Fig.2 Total ion flow map of plasma of rats in each group in positive (A) and negative ion mode (B)

圖3 正、負離子模式下各組大鼠血漿樣本的PCA (A) 和OPLS-DA (B、C) 散點圖Fig.3 PCA (A) and OPLS-DA (B,C) scatter plot of plasma sample in rats in positive and negative ion mode

3.2.3 與發(fā)熱相關的生物標志物指認 挑選OPLS-DA模塊下VIP＞1的數(shù)據(jù)，通過MassProfiler Professional軟件的t檢驗，以P＜0.05為條件篩選潛在代謝標志物，進行下一步標志物鑒定。通過HMDB數(shù)據(jù)庫搜索，如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠血漿中共發(fā)現(xiàn)7個具有統(tǒng)計學意義的代謝標志物，分別為酮亮氨酸、鞘磷脂[d17∶1/24∶1 (15Z)]、鞘磷脂[d18∶1/24∶1 (15Z)]、鞘磷脂[d18∶1/18∶1 (9Z)]、磷脂酰膽堿（16∶0/14∶0）、磷脂酰膽堿（18∶0/15∶0）、磷脂酰膽堿（16∶0/16∶0），其含量均顯著上調（P＜0.05、0.01）。

3.2.4 三臣小兒退熱貼膏對潛在生物標志物的回調作用 進一步分析三臣小兒退熱貼膏組與模型組大鼠血漿中潛在生物標志物的差異，發(fā)現(xiàn)三臣小兒退熱貼膏能夠回調酮亮氨酸、鞘磷脂[d18∶1/24∶1 (15Z)]、磷脂酰膽堿（16∶0/16∶0）等潛在生物標志物的含量。此外，三臣小兒退熱貼膏能夠上調牛磺酸和異檸檬酸含量，表明三臣小兒退熱貼膏能夠通過回調7種生物標志物，并上調牛磺酸和異檸檬酸含量，從而發(fā)揮解熱、抗炎的作用。

3.2.5 代謝途徑分析 利用HMDB和KEGG數(shù)據(jù)庫對篩選出來的模型組和三臣小兒退熱貼膏組大鼠血漿中的差異化學成分進行通路分析。如圖4所示，所篩選出的差異化學成分涉及?；撬岷蛠喤；撬岽x、乙醛酸和二元酸代謝、檸檬酸循環(huán)、初級膽汁酸生物合成、煙酸和煙酰胺代謝、鞘脂代謝以及纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸代謝等通路，表明三臣小兒退熱貼膏通過調控以上代謝通路發(fā)揮退熱作用。

4 討論

目前市場上出現(xiàn)多種解熱貼產(chǎn)品，但均利用凝膠的物理降溫作用實現(xiàn)解熱作用。本研究制備的蒙藥三臣小兒退熱貼膏具有中藥退熱、物理降溫的雙重解熱作用?；|中的凝膠能夠通過蒸發(fā)凝膠中水分，帶走皮膚表面的熱量從而發(fā)揮物理降溫作用；而蒙藥三臣丸經(jīng)皮吸收后，能夠調節(jié)體內的多條能量代謝通路從而實現(xiàn)降溫退熱作用。結果顯示，三臣小兒退熱貼膏對干酵母致發(fā)熱大鼠模型具有顯著的解熱功效，且呈劑量相關性，其中高、中劑量組療效最佳。雖然阿司匹林退熱效果確切且快速，但三臣小兒退熱貼膏退熱呈持久、平穩(wěn)的趨勢，更符合小兒用藥，同時也符合蒙藥多次反復給藥的特征。

表3 各組大鼠血漿代謝生物標志物的相對含量 ( ±s,n = 8)Table 3 Relative content of metabolic biomarkers in plasma of rats in each group ( ±s,n = 8)

表3 各組大鼠血漿代謝生物標志物的相對含量 ( ±s,n = 8)Table 3 Relative content of metabolic biomarkers in plasma of rats in each group ( ±s,n = 8)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 *P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group

差異代謝物 相對含量 對照 模型 高劑量三臣小兒退熱貼膏 牛磺酸 43.92±7.79 48.60±6.75 54.55±6.75# 異檸檬酸 2.99±0.75 2.62±0.26 4.02±0.86## 酮亮氨酸 4.63±0.98 15.37±13.67* 4.66±1.09# 磷脂酰膽堿（16∶0/16∶0） 20.76±1.51 29.47±2.46** 25.84±1.97## 磷脂酰膽堿（18∶0/15∶0） 0.59±0.09 0.77±0.16* 0.66±0.09# 磷脂酰膽堿（16∶0/14∶0） 1.74±0.33 2.41±0.29** 2.06±0.17## 鞘磷脂[d18∶1/18∶1 (9Z)] 0.83±0.12 1.51±0.18** 1.39±0.17# 鞘磷脂[d18∶1/24∶1 (15Z)] 12.08±1.63 13.99±1.55* 12.36±1.78# 鞘磷脂[d17∶1/24∶1 (15Z)] 1.00±0.07 1.23±0.05** 1.14±0.09##

圖4 正離子 (A)、負離子 (B) 模式下三臣小兒退熱貼膏組與模型組血漿差異化學成分的代謝通路分析Fig.4 Analysis of metabolic pathway of differential chemical composition in plasma between Sanchen Xiaoer Antipyretic Plaster and model group in positive (A) and negative (B) ion mode

研究發(fā)現(xiàn)，干酵母致發(fā)熱大鼠血漿中花生四烯酸、磷脂酰膽堿、琥珀酸、乳酸、3-呋喃甲酸、煙酸等多種代謝物水平上調[21]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血漿中共篩選出7種主要的潛在發(fā)熱相關生物標志物，其中磷脂酰膽堿與以往報道相同，而酮氨酸、神經(jīng)鞘脂是本研究中新發(fā)現(xiàn)的差異代謝物。經(jīng)三臣小兒退熱貼膏治療后，7種生物標志物含量均顯著回調，同時血漿中?；撬岷彤悪幟仕岷可?，可協(xié)同發(fā)揮解熱、抗炎作用。三臣小兒退熱貼膏組方以人工牛黃為主藥，主成分為?；撬醄22]。?；撬崮軌蛞种颇懼崮な荏w介導的大鼠肺泡巨噬細胞NR8383分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6），從而發(fā)揮抗炎、免疫調節(jié)的作用[23]。檸檬酸是一種天然的抗氧化劑，能夠抑制白細胞的髓過氧化物酶活性，發(fā)揮抗炎作用[24]。此外，模型組大鼠血漿中升高的6種代謝差異物均屬脂肪類成分。研究表明，下丘腦對棕色脂肪組織的產(chǎn)熱具有抑制作用[25]。但當致熱原刺激下丘腦前部體溫調節(jié)中樞神經(jīng)元時，能夠解除其對脂肪組織的抑制作用，加快脂肪分解產(chǎn)熱，破壞機體產(chǎn)熱散熱動態(tài)平衡，導致機體異常發(fā)熱[26]。三臣小兒退熱貼膏能夠降低血漿中脂類物質水平，提示其可通過影響脂肪酸分解供能，從而調節(jié)能量供應來發(fā)揮解熱作用。代謝組學結果表明，三臣小兒退熱貼膏對干酵母致發(fā)熱大鼠的代謝紊亂也具有一定調節(jié)作用，其作用機制可能與酶抑制、氨基酸代謝、脂肪代謝、乙醛酸和二元酸代謝、檸檬酸循壞、初級膽汁酸生物合成、α-亞麻酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、鞘脂代謝以及纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸代謝等通路有關，具有靶點多態(tài)性，符合現(xiàn)代蒙藥多成分、多靶點、多通路協(xié)同發(fā)揮作用的整體觀點。本研究初步闡明蒙藥三臣小兒退熱貼膏的解熱作用機制，為三臣小兒退熱貼膏臨床治療小兒發(fā)熱癥提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突