張燕星，呂浩北，黃冬梅，趙志國(guó)★，陳盟

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德；2.承德市中心醫(yī)院，河北 承德）

0 引言

隨著經(jīng)濟(jì)水平的進(jìn)步，各種新興醫(yī)療技術(shù)在提高治愈率的同時(shí)，院內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)也在逐步上升[1]，醫(yī)院呼吸內(nèi)科感染率較高，治療周期長(zhǎng)，臨床抗菌藥物使用難度大，因此及時(shí)準(zhǔn)確的病原菌鑒定及同源性分析對(duì)臨床優(yōu)化抗菌藥物至關(guān)重要。本研究通過(guò)收集2020年11月至2021年3月呼吸內(nèi)科住院患者檢出的病原菌，監(jiān)測(cè)其分布及同源性，旨在發(fā)現(xiàn)耐藥菌株的傳播情況，為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

選取2020年11月至2021年3月我院呼吸內(nèi)科住院患者分離病原菌，剔除同一患者分離的重復(fù)菌株，獲得目的菌株89株。

1.1.2 儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，基質(zhì)液：VITEK MS-CHCA；培養(yǎng)基（鄭州安圖生物）；質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 8739、ATCC 25922（衛(wèi)生部臨檢中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐藥檢測(cè)

按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用VITEK MS RUO模式鑒定病原菌，藥敏試驗(yàn)采用MIC或K-B法，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所最新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判定（CLSI M100-ED29）。

1.2.2 質(zhì)譜鑒定及同源性分析

接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，均勻涂在靶板上，立刻加1 μL的CHCA基質(zhì)液，干燥后應(yīng)用VITEK MS RUO模式對(duì)目的菌株進(jìn)行鑒定，利用SARAMIS軟件分析其同源性。

1.2.3 病原體耐藥表型

對(duì)CRKP行mCIM和eCIM實(shí)驗(yàn)。mCIM：取待測(cè)菌株1 μL接種TSB肉湯試管中，渦旋15 s，放入10 μg美羅培南紙片，35 ℃孵育4 h，取出紙片放入ATCC 25922涂布的MH培養(yǎng)基上，35 ℃孵育18 h，量取抑菌圈直徑。eCIM：于TSB肉湯試管加0.5 M EDTA20 μL，其余步驟與eCIM一致。具體結(jié)果按照2020版CLSI M100進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用WHONET 5.6和SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料通過(guò)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分布

2020年11月至2021年3月我院呼吸內(nèi)科送檢合格標(biāo)本375株，檢出病原菌89株，其中肺炎克雷伯氏菌25株。送檢主要標(biāo)本為痰標(biāo)本，占比82.02%，各標(biāo)本之間進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)本分布（n,%）

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)藥敏結(jié)果將KPN分為野生型9株，CRKP型14株，ESBL型2株。野生型哌拉西林耐藥率為6.7%，ESBL型頭孢吡肟耐藥率為23.5%，CRE替加環(huán)素耐藥率為7.9%，三個(gè)類(lèi)別卡方檢驗(yàn)除哌拉西林和慶大霉素外，其余藥物P＜0.05，見(jiàn)表2。

表2 肺炎克雷伯氏菌耐藥率（%）

2.3 病原菌耐藥表型

mCIM和eCIM實(shí)驗(yàn)顯示，產(chǎn)金屬酶有9株，產(chǎn)絲氨酸酶5株。

2.4 同源性分析

根據(jù)質(zhì)譜儀建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)譜相似性需達(dá)到70%以上，因此該實(shí)驗(yàn)以聚類(lèi)分析結(jié)果中縱坐標(biāo)0.7為差異水平，肺炎克雷伯氏菌可分為5個(gè)質(zhì)譜型別，見(jiàn)圖1。

圖1 肺炎克雷伯氏菌樹(shù)狀圖

3 討論

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)作為一種新型微生物鑒定方式，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷、院感檢測(cè)中[2]，可以對(duì)肺炎鏈球菌、陰溝腸桿菌等病原菌進(jìn)行同源性分析[3-4]。2020年CARSS網(wǎng)顯示，CRKP檢出率持續(xù)上升，死亡率高達(dá)6.16%，顯然已經(jīng)成為臨床上高度重視的病原菌。

本實(shí)驗(yàn)病原菌KPN檢出最多，送檢標(biāo)本中痰標(biāo)本占比最大，各標(biāo)本之間進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，暫不能說(shuō)明病原菌檢出與否與送檢標(biāo)本類(lèi)型有關(guān)。根據(jù)KPN藥敏結(jié)果，將25株KPN分為野生型、ESBL型、CRKP型，其中CRKP檢出最多?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，除哌拉西林和慶大霉素外，其他藥物之間存在差異。野生型大多數(shù)抗菌藥物均較敏感，ESBL型氨基糖苷類(lèi)、酶抑制劑耐藥率較低，CRKP型對(duì)復(fù)方新諾明和替加環(huán)素耐藥率較低；臨床可以根據(jù)藥敏分型使用適合的抗菌藥物，降低藥物選擇性壓力。mCIM和eCIM實(shí)驗(yàn)顯示，產(chǎn)金屬酶9株，占比36%，絲氨酸酶5株，占比20%，與宋靜等[5]研究相比我院產(chǎn)金屬酶菌株較多，可能與地區(qū)流行菌株及用藥習(xí)慣等因素有關(guān)。

根據(jù)建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，以縱坐標(biāo)0.7差異水平，可以將KPN分為5個(gè)質(zhì)譜型別，藥敏表型和質(zhì)譜分型兩者進(jìn)行比較，CRKP型集中一個(gè)質(zhì)譜分型中，而野生型和ESBL型則散在分布，這說(shuō)明質(zhì)譜分型和藥敏分型存在部分相似，也存在不同，可以對(duì)CRKP菌株進(jìn)行同源性分析，追蹤傳染源。李鑫等[6]研究發(fā)現(xiàn)SARAMIS相對(duì)值＞85%可以認(rèn)定為同一型別，本研究顯示8株肺炎克雷伯氏菌具有一定的同源性，有研究表明吸痰造成的氣溶膠會(huì)造成空氣環(huán)境污染[7]，通過(guò)醫(yī)護(hù)人員手或器械與患者交叉?zhèn)鞑?，該?shí)驗(yàn)結(jié)果提醒我院呼吸內(nèi)科應(yīng)注意病房空氣、呼吸機(jī)等消毒，避免耐藥病原菌的傳播。

因?yàn)榧夹g(shù)和資金等原因，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)KPN進(jìn)行分子學(xué)研究；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)收集菌株數(shù)量較少，應(yīng)擴(kuò)充菌株數(shù)量，進(jìn)一步明確病原菌的親緣關(guān)系。