張 軼，王菊勇

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院GCP辦公室 200032)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)作為全球主要的公共衛(wèi)生問題嚴(yán)重威脅人類的生命健康。肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)是NSCLC中最常見的病理類型，具有惡性程度高、局部浸潤和血行轉(zhuǎn)移較早、早期一般無明顯臨床癥狀等特點(diǎn)，明確診斷時(shí)已屬中晚期[1-3]；盡管免疫療法和靶向治療已在臨床中有較廣泛的應(yīng)用，但患者5年生存率仍不足20%[4]。因此LUAD的早期診療對于延緩其惡性進(jìn)程和病死率的降低具有重要意義。

代謝重編程是惡性腫瘤的重要特征之一，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的條件下也不經(jīng)線粒體的氧化磷酸化，而是通過糖酵解途徑攝取葡萄糖生成少量三磷酸腺苷(ATP)和大量乳酸的代謝過程，即“Warburg效應(yīng)”或有氧糖酵解[5]。影響腫瘤代謝重編程的機(jī)制復(fù)雜，其中乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)作為糖酵解通路關(guān)鍵酶之一，能催化糖酵解終末產(chǎn)物丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸，作為合成氨基酸、核酸等細(xì)胞增殖必需的原料，維持組織缺氧微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖[6]。研究表明，LDHA在包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤中過表達(dá)，發(fā)揮類似癌基因的作用[7]。但由于研究方法、干預(yù)措施及樣本來源的巨大差異，其結(jié)論的可靠性亟須大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，并且LDHA在LUAD組織中的生物學(xué)功能及其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系尚待進(jìn)一步探討。因此，本研究基于癌癥基因組圖譜計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜(Human Protein Atlas，HPA)等高通量多組學(xué)數(shù)據(jù)庫，全面分析LDHA基因和蛋白表達(dá)對LUAD臨床病理特征及預(yù)后的影響，旨在為探索LUAD的發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后提供新的研究思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 LUAD組織中LDHA表達(dá)差異分析

GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn/)即基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析，通過該平臺預(yù)測LDHA基因(Ensembl ID：ENSG00000134333)在TCGA數(shù)據(jù)集常見惡性腫瘤及LUAD中的表達(dá)情況。Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org /resource /login.html)是包括基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)和TCGA數(shù)據(jù)在內(nèi)的大型腫瘤生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫，在該數(shù)據(jù)庫中檢索LDHA相關(guān)數(shù)據(jù)集，限定條件如下。Gene：LDHA；Cancer Type：Lung Adenocarcinoma；Analysis Type：Cancervs.Normal Analysis；Data Type：mRNA；Gene Summary：P<0.05，提取各基因芯片信息驗(yàn)證LDHA表達(dá)差異。HPA數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)是基于免疫檢測技術(shù)分析的大型蛋白組數(shù)據(jù)庫，提供了26 000種人類蛋白質(zhì)在48種正常組織和20種腫瘤組織中的分布信息及表達(dá)水平[8]。選取HPA數(shù)據(jù)庫中正常肺組織和LUAD組織的LDHA免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較正常肺組織和LUAD組織中LDHA蛋白表達(dá)水平、抗體染色程度及陽性顆粒分布情況。

1.2 LDHA與LUAD患者臨床病理相關(guān)性預(yù)測

Ualcan在線分析平臺(http://ualcan.path.uab.edu/)收錄了TCGA數(shù)據(jù)集中各類癌癥患者基因表達(dá)情況和臨床病理相關(guān)性圖表，本研究在該平臺中設(shè)定Gene symbol為“LDHA”；TCGA dataset為“Lung Adenocarcinoma”，進(jìn)一步分析LDHA與腫瘤分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、種族、性別、年齡及吸煙習(xí)慣之間的關(guān)系。GEPIA2網(wǎng)站的“Survival Analysis”模塊中預(yù)測LDHA表達(dá)與LUAD患者總生存期(overall survival，OS)及無病生存期(disease-free survival，DFS)的關(guān)系。

1.3 LDHA生物學(xué)功能預(yù)測

通過LinkedOmics網(wǎng)站(http://www.linkefomics.org)獲取LDHA在LUAD中的共表達(dá)基因，篩選Pearson系數(shù)大于0.4的正相關(guān)基因?qū)隡etascape分析平臺(http://metascape.org)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析及共表達(dá)基因互作分析。

1.4 LDHA蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

基于中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺、維普網(wǎng)、PubMed、EMBase、The Cochrane Library等數(shù)據(jù)庫，檢索建庫至2020年12月有關(guān)LDHA與LUAD關(guān)系的研究。參照中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫主題詞及關(guān)鍵詞表、PubMed MeSH詞匯表選擇相應(yīng)檢索詞。中文數(shù)據(jù)庫以“乳酸脫氫酶A”or“LDHA”and“肺腺癌”為檢索詞進(jìn)行檢索；外文數(shù)據(jù)庫以“l(fā)actate dehydrogenase A”or“LDHA”and“l(fā)ung adenocarcinoma”or“LUAD”為檢索詞進(jìn)行檢索，獲取文獻(xiàn)中與LDHA直接或間接相互作用進(jìn)而影響LUAD發(fā)生、發(fā)展、診斷及預(yù)后的蛋白分子，利用STRING-DB(https://string-db.org/)和Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建可視化蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

正常肺組織與LUAD組織中LDHA表達(dá)差異的組間比較，配對樣本采用配對t檢驗(yàn)，非配對樣本采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；LDHA mRNA的表達(dá)與LUAD臨床病理相關(guān)性采用非參數(shù)檢驗(yàn)；Pearson相關(guān)性分析篩選LDHA共表達(dá)基因；采用Kaplan-Meier模型和log-rank檢驗(yàn)評估LDHA表達(dá)與LUAD患者OS和DFS的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 LDHA mRNA在不同腫瘤組織及LUAD中的表達(dá)差異

使用GEPIA2平臺分析LDHA在TCGA數(shù)據(jù)庫常見惡性腫瘤中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，LUAD組織中LDHA的中位表達(dá)值為674.98，明顯高于正常肺組織，見圖1A；進(jìn)一步檢索483例LUAD組織和59例正常肺組織中LDHA mRNA的表達(dá)信息，結(jié)果顯示與正常肺組織相比，LUAD組織中LDHA mRNA表達(dá)水平是正常肺組織的2.44倍(P<0.05)，見圖1B。分析Oncomine數(shù)據(jù)庫中9項(xiàng)共涉及569例LUAD組織和260例癌旁正常組織的基因芯片數(shù)據(jù)集，結(jié)果顯示LDHA mRNA在LUAD組織中較正常肺組織高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 LDHA mRNA在不同腫瘤組織及LUAD中的表達(dá)差異

表1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中LDHA mRNA在不同LUAD研究中的表達(dá)

2.2 LDHA蛋白在LUAD組織中的表達(dá)

為驗(yàn)證上述LDHA mRNA的表達(dá)差異，本研究檢索了HPA數(shù)據(jù)庫中采用LDHA抗體(CAB069404)在LUAD及正常肺組織中的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在3例正常肺組織中抗體均呈低染色水平，3例LUAD組織中均呈強(qiáng)染色或中等染色水平，且陽性染色顆粒主要位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上。這一結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)了LDHA蛋白在LUAD組織中較正常肺組織高表達(dá)，見圖2。

圖2 LDHA蛋白在LUAD組織和正常肺組織中的表達(dá)(IHC)

2.3 LDHA與LUAD臨床病理特征的關(guān)系

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫對LDHA表達(dá)水平與LUAD臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，LDHA表達(dá)與腫瘤分期呈正相關(guān)(P<0.05)，且隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量增加而表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，但與患者的種族、性別、年齡和吸煙習(xí)慣無關(guān)，見圖3。

A：LDHA表達(dá)與腫瘤分期的關(guān)系；B：LDHA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系；C：LDHA表達(dá)與種族的關(guān)系；D：LDHA表達(dá)與性別的關(guān)系；E：LDHA表達(dá)與年齡的關(guān)系；F：LDHA表達(dá)與吸煙習(xí)慣的關(guān)系。

2.4 LDHA對LUAD患者預(yù)后的影響

為明確LDHA是否對LUAD患者預(yù)后存在影響，本研究在GEPIA2網(wǎng)站下載了TCGA數(shù)據(jù)庫中478例LUAD患者的生存信息，從LDHA mRNA表達(dá)水平的50%取截?cái)嘀祵⒃摂?shù)據(jù)集分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，每組各239例。Kaplan-Meier單因素生存分析結(jié)果顯示，LDHA mRNA低表達(dá)組的OS優(yōu)于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(logrankP<0.01，HR=1.9)，但兩組患者的DFS無明顯差異(logrankP=0.16，HR=1.2)，見圖4。

2.5 LDHA在LUAD中潛在分子調(diào)控機(jī)制預(yù)測

在LinkedOmics網(wǎng)站獲取LDHA在TCGA LUAD數(shù)據(jù)庫中共表達(dá)基因。將篩選出的191個(gè)正相關(guān)基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行GO基因富集分析和KEGG通路分析。GO分析結(jié)果顯示，LDHA在LUAD中正相關(guān)表達(dá)的基因主要富集的生物學(xué)過程有：細(xì)胞分裂、嘌呤核糖核苷三磷酸代謝、細(xì)胞周期相變、有絲分裂的微管細(xì)胞骨架組成、DNA復(fù)制等；涉及的細(xì)胞組分有：染色體著絲粒區(qū)、中心顆粒體、微管組織中心、微管和線粒體包膜等；涉及的分子功能有：鈣粘蛋白結(jié)合、單糖結(jié)合、激酶結(jié)合和異構(gòu)酶活性等，見圖5。KEGG信號通路主要涉及糖酵解途徑、細(xì)胞周期、蛋白酶體、嘌呤代謝、磷酸戊糖途徑、人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒I型(human T-lymphotropic virus tupe-1，HTLV-1)感染、腺嘌呤核苷酸生物合成、細(xì)胞凋亡、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等，提示LDHA可能通過上述途徑影響LUAD細(xì)胞惡性增殖和患者的臨床預(yù)后，見表2。PPI網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步表明，LDHA可能與腫瘤糖酵解過程密切相關(guān)，具體結(jié)果如圖6所示，其中MCODE1代表糖酵解途徑和細(xì)胞周期；MCODE2代表蛋白酶體生物合成；MCODE3代表核糖體生物合成；MCODE 4代表糖異生過程。

表2 LUAD中LDHA共表達(dá)基因的KEGG通路富集分析

圖5 LUAD中LDHA共表達(dá)基因的GO功能富集分析

圖6 LDHA在LUAD中共表達(dá)基因互作分析

2.6 LDHA蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

依據(jù)上述文獻(xiàn)檢索策略，初步獲取76篇文獻(xiàn)，通過閱讀文題、摘要、正文及軟件去重進(jìn)行篩選，最終納入32個(gè)與LDHA直接或間接相互作用進(jìn)而影響LUAD的蛋白分子，見表3。PPI預(yù)測分析結(jié)果顯示，有26種蛋白與LDHA可能存在直接相互作用聯(lián)系，排名前10位的分別為絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT Serine/Threonine Kinase 1，AKT1)、POU結(jié)構(gòu)域5類轉(zhuǎn)錄因子1(POU domain class 5 transcription factor 1，POU5F1，OCT4)、M型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M，PKM)、溶質(zhì)載體家族2(solute carrier family 2，SLC2A1)、轉(zhuǎn)錄因子Sox2(transcription factor Sox2，SOX2)、低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、丙糖磷酸異構(gòu)酶1(triosephosphate isomerase 1，TPI1)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin，CDH2)、Twist相關(guān)蛋白1(Twist-relatedprotein 1，TWIST1)和鋸齒形典型缺口配體1(Jagged Canonical Notch Ligand 1，JAG1)，見圖7。

A：總生存曲線；B：無病生存曲線。

表3 LUAD中LDHA相關(guān)作用蛋白

續(xù)表3 LUAD中LDHA相關(guān)作用蛋白

圖7 LDHA相關(guān)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

3 討 論

LDHA是由LDHA、LDHB或LDHC 3個(gè)獨(dú)立基因編碼的同源或異源四聚體，其中LDHA和LDHB基因分別編碼的M和H蛋白亞基可構(gòu)成5種LDH同工酶(LDH1～5)，LDHC僅構(gòu)成LDH-C4一種同工酶[23]。由4個(gè)M亞基組成的LDHA(LDH5)已被證實(shí)在多種實(shí)體腫瘤組織中以HIF-1α依賴性方式上調(diào)表達(dá)[24]。LDHA作為Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵酶之一，其異常表達(dá)在包括肺癌、胰腺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等多種人類癌癥中普遍存在，通過調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子直接或間接促進(jìn)惡性腫瘤的增殖與侵襲過程[25-26]。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)LDHA的表達(dá)能使LUAD小鼠移植瘤發(fā)生減少和已形成的腫瘤消退[27]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制LDHA活性可促使線粒體功能再激活，明顯抑制LUAD細(xì)胞系A(chǔ)549和H1975的生長[28]。Meta分析顯示，治療前較高的LDH濃度與總體生存率較差有關(guān)，血清LDH水平可作為預(yù)測肺癌患者存活率的生物標(biāo)志物[29]。

隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的高通量測序數(shù)據(jù)可以公開獲取。由于NSCLC分型多樣，為進(jìn)一步明確LDHA在LUAD中的表達(dá)差異及潛在分子調(diào)控機(jī)制，準(zhǔn)確推測該基因?qū)UAD疾病進(jìn)展的影響，本研究利用GEPIA2在線分析平臺挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫中的大樣本規(guī)范數(shù)據(jù)，納入59例正常肺組織和515例LUAD組織，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出LDHA mRNA在LUAD中的表達(dá)約是正常肺組織的2.44倍。Oncomine數(shù)據(jù)庫中9個(gè)獨(dú)立微陣列基因芯片結(jié)果均表明LDHA mRNA在LUAD組織中過表達(dá)。又通過HPA數(shù)據(jù)庫對該基因編碼蛋白的免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LDHA蛋白在正常肺組織中呈低表達(dá)或未檢出，而在LUAD組織中呈中、高程度表達(dá)，與mRNA分析結(jié)果相一致。臨床病理特征分析顯示，LDHA與LUAD的病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量呈正相關(guān)，而與患者的種族、性別、年齡和吸煙習(xí)慣無關(guān)。一項(xiàng)對190例晚期NSCLC患者治療前血清LDH水平與表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑治療效果的研究表明，治療前LDH升高與患者較短的OS和PFS有關(guān)[30]。本研究利用Kaplan-Meier法分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中的生存數(shù)據(jù)，證實(shí)了LUAD組織中LDHA高表達(dá)組患者的OS明顯低于低表達(dá)組，提示LDHA可作為潛在有價(jià)值的生物標(biāo)志物監(jiān)測LUAD患者病情進(jìn)展。

目前針對LDHA基因在LUAD中表達(dá)的潛在分子調(diào)控機(jī)制鮮有研究，在TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索出191個(gè)與LDHA基因Pearson相關(guān)系數(shù)大于0.4的基因，利用Metascape工具對其進(jìn)行生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能注釋和KEGG通路富集分析，將文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫檢索出與LDHA直接或間接相互作用影響LUAD的蛋白因子納入STRING-DB網(wǎng)站識別構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)該基因與影響糖酵解途徑的PKM、SLC2A1、HIF-1α和TPI1等密切相關(guān)。LDHA高表達(dá)主要富集了細(xì)胞分裂、嘌呤核糖核苷三磷酸代謝過程、細(xì)胞周期、有絲分裂的微管細(xì)胞骨架組成、DNA復(fù)制、減數(shù)分裂、核糖核蛋白復(fù)合物的合成等生物學(xué)過程，涉及糖酵解、磷酸戊糖途徑、嘌呤代謝和糖異生等能量代謝信號通路。由于染色體不穩(wěn)定、拷貝數(shù)變化的逐步積累和等位基因失衡賦予了肺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的相關(guān)特征[31]。此外，LDHA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解，導(dǎo)致乳酸生成增加，酸性腫瘤微環(huán)境有助于腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[32]。已有研究表明，程序性死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)在EGFR突變和K-Ras突變的NSCLC組織中均表達(dá)升高，且乳酸能夠誘導(dǎo)PD-L1水平上調(diào)，降低干擾素-γ的產(chǎn)生，削弱腫瘤浸潤的殺傷性CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化，引發(fā)T淋巴細(xì)胞衰竭，克服肺癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視[33-35]。因此，干預(yù)腫瘤的代謝途徑以調(diào)節(jié)腫瘤的免疫功能，開發(fā)結(jié)合免疫療法和代謝靶向療法的藥物是肺癌治療的潛在策略之一。

綜上所述，本研究通過高通量多組學(xué)數(shù)據(jù)庫納入足夠的樣本數(shù)量和真實(shí)可靠的研究結(jié)果，對LDHA在LUAD中潛在的生物學(xué)作用和預(yù)后影響進(jìn)行分析挖掘，為進(jìn)一步探索LDHA的生物學(xué)作用和分子機(jī)制提供了具有更高可信度的理論依據(jù)，同時(shí)為臨床診療和預(yù)后判斷提供重要的參考價(jià)值。