藺澤榮，朱海霞

(青海省農林科學院，農業(yè)部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海省農業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016)

藜(Chenopodiumalbum)為一年生草本植物，廣泛分布于田間，生長速度快，生命力頑強，種子數(shù)量大，與作物爭奪營養(yǎng)物質，且是某些土壤害蟲的寄主[1-2]，是危害作物正常生長的主要雜草之一.

從自然感病的大刺兒菜中分離得到的菌株HZ-31發(fā)酵液對闊葉雜草有較好的除草效果[20].木霉屬真菌種類眾多、分布廣泛，在農業(yè)、工業(yè)和環(huán)境修復領域應用廣泛[3]，由于其具有顯著的生物防治效果和重要的生物應用價值,被公認為是一種可取代化學藥品的農作物保護劑.楊榕等[4]的研究結果表明，長枝木霉MF-2對黃瓜幼苗有促生作用.王騰等[5]的研究結果表明，板栗外生菌根真菌螺旋木霉和鉤狀木霉有拮抗13種以上病原菌的作用，具有廣譜性，可選為生物菌劑的潛力菌種.木霉次生代謝產物的化學多樣性是其有效生物防治潛力的來源[6-7].本試驗中多孢木霉HZ-31作為大刺兒菜的病原真菌，應用于田間雜草有廣譜的除草作用，具有生防除草的潛力[8-9].

在植物代謝過程中，葉綠體、線粒體和質膜上的電子傳遞都可能產生活性氧(ROS)，如超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH·)、過氧化氫(H2O2)等[10-20].植物受到寒冷、干旱、鹽害和病原物侵染等危害時，植物體內會產生活性氧，但是過量或者缺乏活性氧含量都會影響植物的生理變化，而病原物侵入植物的反應是以酶含量的變化或中間產物的介入來實現(xiàn)的.El Alaoui-Talibi等[12,21]研究表明，多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)是重要的抗性催化合成酶，不僅可加速酚類化合物質量的氧化，而且參與植物的抗病性.在植物正常生命活動代謝中，植物體內的防御酶類系統(tǒng)都會產生清除活性氧的酶類，避免由活性氧的積累破壞植物膜系統(tǒng)而影響植物正常生長[11].

本研究以青海省常見的田間雜草藜作為研究對象，菌株HZ-31作為致病因子，探究病原物在對寄主的致病過程中寄主植物體內的生理酶和蛋白酶的變化，借此來探索除草機理.通過測定防御蛋白酶POD、過氧化氫酶(CAT)、PPO、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)變化，探究接種病原物后植物體內產生酚類物質和氧化物對病原物的抵抗或抑制作用；通過測定葉綠素含量和可溶性糖含量的變化來觀察植物受病原物刺激后表現(xiàn)出的抗性和生長現(xiàn)象；通過測定丙二醛(MDA)含量變化來反應植物受病原物入侵后其細胞膜的受損情況.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

多孢木霉HZ-31由青海省農科院植保所有害生物綜合防治實驗室，從自然感病的大刺兒菜上分離得到，并保存于該實驗室[5].

1.2 試驗方法

1.2.1 HZ-31發(fā)酵液制備 將實驗室保存的多孢木霉HZ-31接種于PDA培養(yǎng)基中活化，25 ℃條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，用打孔器(Φ=8 mm)打菌餅接于PDB中，每250 mL三角瓶接5個菌餅，每個處理重復3次，在25 ℃的搖床中晝夜交替培養(yǎng)7 d，待用.

1.2.2 HZ-31發(fā)酵液接種藜試驗 將青海省農林科學院試驗地(E 101.74°，N 36.56°)田間生長6～12葉期，葉色正常的藜(灰藜)幼苗移栽于直徑15 cm花盆中，于實驗室內培養(yǎng)一周.將HZ-31發(fā)酵液稀釋成濃度為1.0×108個/mL的孢子懸浮液，加入適量0.05%吐溫-20作為潤濕劑，噴霧接種到移栽的健康藜植株上，接種量為30 mL/盆.接種后于100%的相對濕度下保持24 h，隨后自然培養(yǎng)，接種無菌PDB的植株作為空白對照.分別在接種后1～7 d取樣，隨機挑選兩株，每株采取3片葉片，每個處理重復3次，置于-80 ℃冰箱冷凍.

1.2.3 HZ-31菌株對藜植株生理機制的影響 按照酶活試劑盒(南京建成生物工程研究所生產)步驟，進行HZ-31菌株接種藜后植株體內丙二醛(MDA)含量、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活力、多酚氧化酶(PPO)活力、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力、可溶性糖含量和葉綠素含量的測定.

1.2.4 數(shù)據處理 運用Excel 2010和SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，采用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析.

2 結果與分析

2.1 多孢木霉HZ-31菌株侵染對藜生長的影響

多孢木霉HZ-31菌株侵染對藜生長具有顯著的影響，接種HZ-31菌株3 d后，藜植株出現(xiàn)輕度萎蔫(圖1-A)；接種5 d后，萎蔫程度加重，葉片侵染部位失綠變白(圖1-B)，7 d后受侵染植株葉片失綠變白程度加重(圖1-C).

2.2 藜的生理機制變化

2.2.1 丙二醛(MDA)含量的變化 多孢木霉HZ-31侵染藜后，對照組藜MDA含量呈“M”型變化，最大為1.74 nmol/mg；處理組MDA含量先上升至最大4.62 nmol/mg，1～4 d內處理組藜MDA含量高于對照組然后開始下降，最大增幅67.91%.

2.2.2 過氧化氫酶(CAT)活力的變化 多孢木霉HZ-31侵染藜后，對照組藜CAT活力呈“升-降-升-降-升-降-升”的變化趨勢，最高達6.23 U/mg；處理組藜CAT活力第1天開始緩慢上升，至最大5.70 U/mg，比對照增加81.88%；第5天開始呈“V”型變化趨勢，前4 a內處理組藜CAT活力低于對照組，4天后處理組藜CAT活力顯著高于對照組.

A：藜接種3 d后的生長狀況；B：藜接種5 d后的生長狀況；C：藜接種7 d后的生長狀況.A：Growth status of Chenopodium album at 3 days after inoculation；B：Growth status of Chenopodium album at 5 days after inoculation；C：Growth status of Chenopodium album at 7 days after inoculation.圖1 藜接種HZ-31發(fā)酵液后的生長狀況Figure 1 Growth status of Chenopodium album inoculated with HZ-31 fermentation broth

圖2 多孢木霉HZ-31處理后藜的丙二醛含量變化Figure 2 Changes of malondialdehyde content of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

2.2.3 過氧化物酶(POD)活力的變化 多孢木霉HZ-31侵染藜后，對照組和處理組藜POD活力處于平穩(wěn)變化狀態(tài)，且處理組始終高于對照組，最大增加46.44%，第7天后開始下降.

圖3 多孢木霉HZ-31處理后藜的過氧化氫酶活力的變化Figure 3 Changes of catalase activity of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

圖4 多孢木霉HZ-31處理后藜的過氧化物酶活力變化Figure 4 Changes of peroxidase activity of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

2.2.4 多酚氧化酶(PPO)活力的變化 圖5顯示，接種菌株HZ-31后，對照組藜PPO活力呈“N”型變化趨勢，第3天達到最大峰值，為2.61 U/g；處理組藜PPO活力變化趨勢和對照組相似，比對照顯著增加，迅速達到酶活性峰值，為2.78 U/g，第3天開始緩慢下降，第6天后又呈現(xiàn)出上升趨勢，處理組始終高于對照組，最大增幅37.68%.

圖5 多孢木霉HZ-31處理后藜的多酚氧化酶活力的變化Figure 5 Changes of polyphenol oxidase activity of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

2.2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的變化 圖6顯示，接種菌株HZ-31后，對照組和處理組藜PAL活力在1～3 d內變化平穩(wěn)，且變化趨勢相似，從第1天開始處理組藜的PAL活力高于對照組，第4天達到最大值72.21 U/g，且處理組PAL活力顯著增加，最大增幅為78.62%.

2.2.6 可溶性糖含量的變化 圖7顯示，藜接種菌株HZ-31后，對照組藜的可溶性糖含量呈“倒N”型變化，第5天達到峰值，為21.74 mg/g；處理組藜可溶性糖含量呈上升趨勢，第4天達到峰值，為26.30 mg/g，第4天后開始下降；處理組始終高于對照組，最大增幅為69.37%.

圖6 多孢木霉HZ-31處理后藜的苯丙氨酸解氨酶活力變化Figure 6 Changes of phenylalanine ammonia lyase activity of Chenopodium album after Trichoderma Polysporum HZ-31 Treatment

圖7 多孢木霉HZ-31處理后藜的可溶性糖含量的變化Figure 7 Changes of soluble sugar content of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

2.2.7 葉綠素含量的變化 圖8顯示，藜接種菌株HZ-31后，對照組藜葉綠素含量變化幅度大，第4天達到峰值，為6.98 mg/g.處理組藜葉綠素含量變化較平穩(wěn)，呈現(xiàn)下降趨勢，3～6 d內處理組葉綠素含量低于對照組，最大降幅68.04%.

2.2.8 超氧化物歧化酶(SOD)活力的變化 圖9顯示，多孢木霉HZ-31侵染藜后，第3天開始對照組和處理組藜SOD活力均呈“W”型變化，處理組在第3天達到峰值，為220.86 U/mg，且處理組SOD活力高于對照組，最大增加8.12%.藜受菌株HZ-31刺激后SOD迅速增強，保護酶濃度升高，第6天后對照組與處理組均呈現(xiàn)增長趨勢，且對照組變化快于處理組.

圖8 多孢木霉HZ-31處理后藜的葉綠素含量變化Figure 8 Changes of chlorophyll content of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

圖9 多孢木霉HZ-31處理后藜的超氧化物歧化酶活力變化Figure 9 Changes of superoxide dismutase activity of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

3 討論與結論

接種HZ-31菌株后，迫使藜體內的生理系統(tǒng)發(fā)生變化，隨著接種時間的增長，變化趨勢顯著.各處理的MDA含量和PPO活性均顯著高于對照，且最大分別提高了67.91%和37.68%，說明防御系統(tǒng)產生抗性機制抵御外界刺激的傷害；葉綠素第3天后低于對照，說明藜被侵染后逐漸失綠而不能正常生長；PAL呈先升高后下降的變化，且始終高于對照，表明藜始終受體內PAL的保護，濃度越高效果越好.藜的細胞組織被破壞，葉片逐漸黃化，最終枯萎死亡.本研究中MDA 含量受刺激后逐漸降低，這與趙戴軍等[19]的研究結果相符合.SOD主要是與POD和CAT等協(xié)同作用的,由CAT通過乙醛酸循環(huán)體、線粒體和過氧化物酶體將H2O2進一步氧化成H2O和O2,清除病原物侵染植物后所產生的活性氧.本研究中，各處理CAT活力顯著高于對照，這與李培玲等[15]的研究結果一致.POD含量平穩(wěn)變化且始終高于對照，而SOD呈“W”變化且顯著高于對照，這與陸建英等[16]研究結果一致，刺激能增加POD酶和SOD酶的含量.本研究中，藜葉片受HZ-31菌株刺激后，PPO酶的活性呈現(xiàn)先增加后降低，然后再增加的變化趨勢，這與張藝萍等[22]研究中報道的防御酶活性提高，增強了植物抵抗逆境的能力的論點略有差異，可能與取樣的時間和地點有一定的關系.藜可溶性糖含量呈先增加后降低再增加的變化趨勢，但處理始終高于對照，這與李張等[18]的研究結果相反，這可能是因為菌液的濃度較高引起的差異.

多孢木霉HZ-31菌株侵染藜后，其生理機制防御酶變化如下：過氧化物酶(POD)活力、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力和可溶性糖含量一直高于對照組，分別增加46.44%、72.21%、8.12%和69.37%.隨著防御酶活性升高，防御能力也逐漸增強.過氧化氫酶(CAT)活力、多酚氧化酶(PPO)活力和丙二醛(MDA)含量先升高后降低，說明藜受菌株HZ-31侵染后防御酶被激活，增強了對侵染的防御能力，隨著侵染程度的增強，防御酶活含量降低，活力減弱，細胞膜損害程度加重，植物體對外界的抵抗力減弱.葉綠素含量持續(xù)降低，說明藜被侵染后光合作用受到抑制，導致葉片失綠.