侯建華，王劼，周玉碧，武志博

(1.中國科學院藏藥研究重點實驗室，青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室，中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國科學院大學，北京 100049；3.阿拉善盟林業(yè)治沙研究所，內蒙古 巴彥浩特 750399)

荒漠肉蓯蓉(CistanchedeserticolaMa)為列當科肉蓯蓉屬植物，是我國藥食兩用的中藥材，具有補腎陽、益精血、潤腸通便等功效，素有“沙漠人參”之稱[1].荒漠肉蓯蓉在我國主要分布于新疆維吾爾族自治區(qū)、內蒙古自治區(qū)、甘肅省、寧夏回族自治區(qū)等[2].近年來由于無節(jié)制采伐，使得荒漠肉蓯蓉野生資源瀕臨滅絕，已被納入《國際野生植物保護名錄》[3].現(xiàn)肉蓯蓉藥材來源主要以栽培為主，內蒙古和新疆地區(qū)為其主要產區(qū).由于我國健康產業(yè)的迅速發(fā)展，以及阿拉善荒漠肉蓯蓉已申報為新食品原料，使得藥材資源的需求急劇增加.藥材資源往往存在道地性，不同產區(qū)生產的藥材品質存在明顯差異[4-5]，因此系統(tǒng)地研究荒漠肉蓯蓉能夠有效地推動沙生植物資源的可持續(xù)開發(fā)利用.

已有研究表明，荒漠肉蓯蓉中含有多種化學成分，如苯乙醇苷類、多糖類、木質素及其苷類、環(huán)烯醚萜類和黃酮類等化合物，其中苯乙醇苷類為其主要活性成分，并具有顯著的藥理活性特征，松果菊苷和毛蕊花糖苷為其主要指標成分[6-8].研究人員已通過高效液相色譜、超高效液相色譜、質譜和核磁共振等技術對苯乙醇苷化學成分了研究，發(fā)現(xiàn)苯乙醇苷成分不僅在肉蓯蓉屬不同種[9]、同種的不同產地[10]和不同采收時期[11-12]之間存在明顯差異，甚至在同種不同個體和不同部位[13]之間也存在差異.綜上所述，HPLC技術已成為定性定量分析苯乙醇苷成分的一種常用方法，該方法穩(wěn)定高效、準確可行.目前對荒漠肉蓯蓉的研究主要集中在栽培育種、成分分析和遺傳多樣性等方面，但對不同產地樣品化學成分與抗氧化活性綜合對比方面的研究較少.

本研究以新疆維吾爾自治區(qū)、內蒙古自治區(qū)和哈薩克斯坦3個產地的荒漠肉蓯蓉為研究對象，對不同產地樣品中的苯乙醇苷化學成分及樣品醇提物抗氧化活性進行分析，為荒漠肉蓯蓉藥材資源的綜合開發(fā)提供依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

荒漠肉蓯蓉樣品采集于新疆、內蒙古和哈薩克斯坦地區(qū)，在采樣過程中，栽培樣品在同一產地采集穴數(shù)不少于3穴，野生樣品同一穴位采樣株數(shù)不少于3株，同時記錄其生境等地理信息.樣品經甘肅農業(yè)大學孫學剛教授鑒定為列當科肉蓯蓉屬植物荒漠肉蓯蓉(拉丁學名：CistanchedeserticolaMa)，樣品信息見表1.

1.2 試驗儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀(LC-10AD，日本島津公司)；多功能酶標儀(EnSpire2300，珀金埃爾默企業(yè)管理上海有限公司)；電子天平(AUW2200，島津菲律賓工廠)；純水機(UPH-1-40L，四川優(yōu)普超純科技有限公司)；循環(huán)水真空泵(天津津騰實驗設備有限公司)；超聲清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(上海恒一科學儀器有限公司)；紫外分光光度計(上?？茖W精密儀器有限公司).

試劑：苯乙醇苷對照標準品(上海源葉生物科技有限公司)、DPPH試劑(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS試劑(2,2′-連氮基-雙-3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸二銨鹽)、總抗氧化劑能力試劑盒、氫氧化鉀、磷酸、磷酸鹽緩沖溶液、過硫酸鉀、抗壞血酸(VC)、乙腈、甲醇、乙醇、磷酸、濃硫酸、去離子超純水.

表1 荒漠肉蓯蓉樣品信息表

1.3 高效液相色譜

1.3.1 溶液的配制 標準品的配制：稱取7種苯乙醇苷標準品松果菊苷、肉蓯蓉苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷和管花苷B適量，用50%的甲醇溶液溶解，配制成一定濃度的對照品溶液.

樣品溶液的制備：對采集的荒漠肉蓯蓉樣品進行標記、清洗、干燥、粉碎后過200目篩.稱取樣品0.2 g，加入10倍量體積50%甲醇溶液，稱重，靜置浸泡30 min，超聲提取45 min，冷卻后稱重，用50%甲醇溶液補足失重，以4 000 r/min的速度離心20 min，收集濾液，使用前用0.45 nm微孔濾膜過濾后測試分析.

1.3.2 色譜條件的選擇 色譜柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18 column)，柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為330 nm，進樣量為2 μL.以0.1%磷酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行梯度洗脫：0～10 min，16%～22.3%(B)；10～12 min，22.3%～23%(B)；12～16 min，23%～26%(B)；16～23 min，26%～30%(B).

1.3.3 方法學試驗

1.3.3.1 精密度 在所設定的色譜條件下平行測定同一標準品(管花苷A)6次，計算其含量分別為0.489、0.492、0.488、0.487、0.489、0.493 mg/mL，平均值為0.490 mg/mL，RSD值為0.502%.

1.3.3.2 穩(wěn)定性 分別在0、2、4、6、8、12、24 h，平行測定同一荒漠肉蓯蓉樣品6次，以松果菊苷樣品含量為依據，分別計算其含量依次為2.822、2.849、2.823、2.752、2.784、2.785和2.791 mg/mL，平均值為2.801 mg/mL，RSD值為1.157%.

1.3.3.3 重復性 平行制備同一荒漠肉蓯蓉醇溶液6份，在所設定色譜條件下測定樣品溶液6次，以肉蓯蓉A樣品含量為依據，分別計算其含量依次為0.244、0.248、0.244、0.235、0.242、0.244、0.244 mg/mL，平均值為0.243 mg/mL，RSD值為1.546%.

1.4 體外抗氧化試驗

1.4.1 溶液的配制 醇提物的制備：稱取樣品10 g，加入8倍量體積70%的乙醇溶液，冷凝回流提取兩次，每次3～4 h，以10 000 r/min的速度離心5 min，收集并合并濾液后濃縮，經真空冷凍干燥后得到醇提物.

供試液的制備：稱取樣品醇提物及陽性對照(VC)0.1 g，配制成0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL的6個測試品溶液.

1.4.2 試驗方法 DPPH自由基清除試驗：分別量取2 mL不同濃度的樣品溶液，加入0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2 mL，密封混勻，于25℃恒溫避光反應30 min，測定λ=517 nm處測定吸光度Ai；以等體積乙醇溶液代替DPPH溶液為對照組測定吸光度Aj；以等體積超純水代替樣品溶液為空白組，同等條件測定吸光度Ao[14-15].DPPH自由基的清除率S(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%.

ABTS自由基清除試驗：將7.00 mmoL/L的ABTS溶液和2.45 mmoL/L的過硫酸鉀溶液等體積比混合，4℃避光靜置12～14 h，即得ABTS自由基反應底物儲備液.以pH 7.4，10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋儲備液，直至λ=734 nm處ABTS自由基溶液的吸光度A=0.700±0.02.分別量取0.3 mL不同質量濃度的樣品溶液后加入ABTS自由基溶液1.5 mL，密封混勻，室溫避光反應6 min，在λ=734 nm處測定吸光度Ai；以等體積超純水代替ABTS自由基溶液為對照組測定吸光度Aj；以等體積超純水代替樣品溶液為空白組測定吸光度A0[16].ABTS自由基的清除率S(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%.

總抗氧化能力測定試驗：采用總抗氧化能力試劑盒，將FeSO4標準品溶液配置成6個濃度梯度，加入反應試劑，在λ=593 nm處測定標準品吸光度，得到線性回歸方程為：y=11.276x-0.016 1，其中y為吸光度值；x為Fe2+的濃度(μmol/mL)，R2=0.992.此后根據試劑盒測定各樣品的吸光度值y，根據回歸方程求得x.根據公式：總抗氧化能力(μmol/mL)=x×V反總÷V樣=34x，求得樣品相應的總抗氧化能力.

2 結果與分析

2.1 不同產地荒漠肉蓯蓉的苯乙醇苷成分分析

2.1.1 荒漠肉蓯蓉的7種苯乙醇苷成分分析 通過高效液相色譜分析技術，得到了不同產地樣品和標準品的液相譜圖如圖1所示，同時測定了不同產地荒漠肉蓯蓉樣品中的7種苯乙醇苷成分，其含量測定結果見表2.3個產地的荒漠肉蓯蓉樣品中7種苯乙醇苷成分均有檢出.根據《中華人民共和國藥典》的規(guī)定，肉蓯蓉藥材指標成分松果菊苷(C35H46O20)和毛蕊花糖苷(C29H36O15)的總量應不低于0.30%[2]，本研究所測荒漠肉蓯蓉樣品均達到該規(guī)定.

為明確不同產地樣品的差異性，對不同產地樣品苯乙醇苷含量進行方差分析，發(fā)現(xiàn)新疆產地與內蒙古產地樣品中7種苯乙醇苷總含量無顯著性差異(P>0.05)，但內蒙古產地樣品總含量顯著高于哈薩克斯坦產地樣品(P<0.05).內蒙古產地樣品中指標成分松果菊苷和毛蕊花糖苷含量均顯著高于新疆和哈薩克斯坦產地(P<0.05)，新疆和哈薩克斯坦產地荒漠肉蓯蓉中松果菊苷和2′-乙酰毛蕊花糖苷為其主要苯乙醇苷成分.樣品含有的化學成分與活性物質會受到所處地區(qū)的氣候、降水、土壤、日照和寄主等環(huán)境條件的影響，內蒙古因獨特的自然條件使得荒漠肉蓯蓉樣品累積了大量的活性物質，使其成為道地性產地，其品質和療效也優(yōu)于其他產地.

HX、HM、HH和SD分別表示新疆、內蒙古、哈薩克斯坦產地樣品和標準品；1號峰：松果菊苷；2號峰：肉蓯蓉苷A；3號峰：管花苷A；4號峰：毛蕊花糖苷；5號峰：異毛蕊花糖苷；6號峰：2′-乙酰毛蕊花糖苷；7號峰：管花苷B.HX,HM,HH and SD denote samples from Xinjiang,Inner Mongolia,Kazakhstan and standard samples;Peak No.1：Echinacoside;peak No.2：Cistanchein A;Peak No.3：Tubularin A;Peak No.4：Yerbascum glycoside;Peak No.5：Isocurrantin Glycosides;Peak 6：2′-acetyl verbascoside；Peak 7：Tubalin B.圖1 不同產地荒漠肉蓯蓉和標準樣品的液相譜圖Figure 1 HPLC of C.Deserticola from different producing areas and standard samples

表2 不同產地樣品7種苯乙醇苷成分的含量

2.1.2 不同產地荒漠肉蓯蓉的主成分分析 采用SPSS 26軟件對荒漠肉蓯蓉進行主成分分析，將不同產地荒漠肉蓯蓉苯乙醇苷含量經標準化處理后，計算方差貢獻率，見表3.共提取到3個主成分，累積貢獻率達83.824%，能較好地代表荒漠肉蓯蓉大部分成分信息.其主成分得分圖如圖2所示，不同產地荒漠肉蓯蓉可分為3類：新疆產地樣品分為一類，主要集中在中部位置；內蒙古產地分為一類，主要集中在右上部；哈薩克斯坦樣品分為一類，主要集中在左下部.主成分分析能夠將不同產地樣品有效地進行區(qū)分，說明不同產地荒漠肉蓯蓉之間存在明顯差異.

表3 特征值和方差貢獻率

2.2 不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物體外抗氧化活性分析

2.2.1 不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物對DPPH自由基的清除結果 不同產地荒漠肉蓯蓉樣品醇提物對DPPH自由基的清除結果如圖3所示.以VC(抗壞血酸)為陽性對照，在質量濃度為0.025～0.6 mg/mL范圍內，不同產地樣品對DPPH的清除率隨著樣品濃度的增大而增大后趨于平行.在濃度為0.6 mg/mL時，樣品清除率呈現(xiàn)平行趨勢，說明DPPH單電子配對與醇提物中的自由基清除劑的數(shù)量已達到飽和，樣品對DPPH自由基的清除率已達到最大值，且均大于85%，表明不同產地荒漠肉蓯蓉對DPPH自由基均具有良好的清除效果.不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物對DPPH自由基的半數(shù)抑制質量濃度IC50從大到小排序：哈薩克斯坦樣品(0.151 mg/mL)>新疆樣品(0.092 mg/mL)>內蒙古樣品(0.090 mg/mL)>VC(0.003 mg/mL).新疆與內蒙古產地樣品對DPPH自由基清除能力的IC50無顯著差異(P>0.05).即不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物對DPPH自由基的清除能力從大到小排列為：內蒙古樣品≈新疆樣品>哈薩克斯坦樣品.

HX、HM、HH和SD分別表示新疆、內蒙古、哈薩克斯坦產地樣品.HX,HM,HH and SD denote samples from Xinjiang,Inner Mongolia,Kazakhstan.圖2 主成分分析圖Figure 2 Principal component analysis score chart

HX、HM、HH和VC分別表示新疆、內蒙古、哈薩克斯坦產地樣品和維生素C對照品.HX,HM,HH and VC denote the samples from Xinjiang,Inner Mongolia and Kazakhstan and the vitamin C reference substance.圖3 不同產地樣品醇提物對DPPH自由基的清除效果Figure 3 Scavenging effects of alcohol extracts from different areas samples on DPPH free radicals

2.2.2 不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物對ABTS自由基的清除結果 不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物對ABTS自由基的清除結果如圖4所示.不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物在質量濃度為0.025～0.6 mg/mL時，清除率隨著樣品質量濃度的增大而不斷增大，呈現(xiàn)量效關系.在質量濃度為0.6 mg/mL，不同產地樣品醇提物對ABTS自由基清除率均大于94%，表明不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物均對ABTS自由基具有很好的清除效果.不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物對ABTS自由基的半數(shù)抑制質量濃度IC50從大到小排序為：哈薩克斯坦樣品(0.169 mg/mL)>新疆樣品(0.154 mg/mL)>內蒙古樣品(0.136 mg/mL)>VC(0.010 mg/mL).即不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物對ABTS自由基的清除能力從大到小排列為：內蒙古樣品>新疆樣品>哈薩克斯坦樣品.

2.2.3 不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物的總抗氧化能力 不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物的總抗氧化能力如圖5所示.不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物均具有總抗氧化能力，在質量濃度為0.025～0.6 mg/mL范圍，總抗氧化能力隨著樣品濃度的增大而不斷增大.不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物的總抗氧化能力的半數(shù)抑制質量濃度IC50分別為新疆(1.692 μmol/mL)>哈薩克斯坦(0.308 μmol/mL)>內蒙古(0.302 μmol/mL)>VC(0.098 μmol/mL).內蒙古與哈薩克斯坦產地樣品總抗氧化能力IC50無顯著差異(P>0.05)，但與新疆產地樣品差異顯著(P<0.05).表明不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物的總抗氧化能力從大到小排列為：內蒙古樣品≈哈薩克斯坦樣品>新疆樣品.

HX、HM、HH和VC分別表示新疆、內蒙古、哈薩克斯坦產地樣品和維生素C對照品.HX,HM,HH and VC denote the samples from Xinjiang,Inner Mongolia,and Kazakhstan and the vitamin C reference substance.圖4 不同產地樣品醇提物對ABTS自由基的清除效果Figure 4 Scavenging effects of alcohol extracts from different areas samples on ABTS free radicals

2.2.4 荒漠肉蓯蓉抗氧化活性綜合評價 由上分析可知，不同產地荒漠肉蓯蓉在不同指標條件下抗氧化能力有所區(qū)別，故本研究以DPPH、ABTS和總抗氧化能力3種抗氧化能力的IC50為指標，進行多元指標的TOPSIS綜合評價(表4).綜合評價結果表明，不同產地荒漠肉蓯蓉的綜合抗氧化能力由強到弱依次排序為：內蒙古樣品>哈薩克斯坦樣品>新疆樣品.研究表明苯乙醇苷成分具有良好的藥理活性特征[17]，內蒙古荒漠肉蓯蓉的抗氧化能力最強可能與苯乙醇苷成分的含量最高有關系.楊建華等[18]通過對肉蓯蓉屬植物中6種苯乙醇苷類化合物的抗氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)2′-乙?；锘ㄌ擒諏PPH自由基的清除能力最強，哈薩克斯坦樣品醇提物的抗氧化能力可能與高含量的2′-乙酰基毛蕊花糖苷有關.

HX、HM、HH和VC分別表示新疆、內蒙古、哈薩克斯坦產地樣品和維生素C對照品.HX,HM,HH and VC denote the samples from Xinjiang,Inner Mongolia and Kazakhstan and the vitamin C reference substance.圖5 不同產地樣品醇提物的總抗氧化能力Figure 5 Total antioxidant capacity of alcohol extracts from different areas samples

表4 荒漠肉蓯蓉多元指標TOPSIS評價結果

3 討論

為研究藥材的道地性，趙志紅等[19]通過對內蒙古、新疆和寧夏3個產區(qū)荒漠肉蓯蓉進行品質特征研究發(fā)現(xiàn)，不同產地荒漠肉蓯蓉藥效成分含量存在明顯差異，松果菊苷和毛蕊花糖苷以內蒙古產地最高；周曄等[20]通過HPLC-ESI-MS和FTIR方法發(fā)現(xiàn)蒙古國和新疆產地荒漠肉蓯蓉苯乙醇苷成分存在明顯差異.本文對新疆、內蒙古和哈薩克斯坦產地的荒漠肉蓯蓉進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)不同產地樣品中主要的苯乙醇苷成分含量具有明顯差異，內蒙古荒漠肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量最高.荒漠肉蓯蓉的質量受到自身的遺傳特性、環(huán)境條件(溫度、水分、土壤等生態(tài)因素)及人為因素(播種、加工、采收、炮制和運輸?shù)?等影響，而內蒙古因其特殊的自然條件使其主要活性成分含量高于其他產地，成為荒漠肉蓯蓉的道地性產地.且在收集過程中發(fā)現(xiàn)，內蒙古產地荒漠肉蓯蓉較其他產地樣品具有油亮、質地軟、難烘干等特點，符合“油亮、體重、肥厚、質柔潤、味甘”的道地性品質特征[19].新疆產地荒漠肉蓯蓉的苯乙醇苷總含量也很高，表明新疆產地荒漠肉蓯蓉也具有很好的藥用價值.

人體內95%以上的自由基都是氧自由基，這些自由基可嚴重損害人體的細胞、組織，進而引起慢性疾病及衰老效應，適量的補充抗氧化食品是清除人體自由基、增強抗氧化防御系統(tǒng)、延緩衰老、預防疾病的最佳保健方法[21-24].體外抗氧化實驗研究發(fā)現(xiàn)，不同產地荒漠肉蓯蓉醇提物均具有良好的抗氧化效果，對DPPH自由基清除率均達85%以上，對ABTS自由基清除率均達94%以上.通過TOPSIS法對不同產地荒漠肉蓯蓉的抗氧化能力進行綜合評價，發(fā)現(xiàn)內蒙古產地的肉蓯蓉抗氧化活性最強.本文推測醇提物的抗氧化活性與苯乙醇苷的含量有一定關系，苯乙醇苷含量較高的樣品其抗氧化能力越強.有學者指出苯乙醇苷的抗氧化能力與苷元及苯丙烯?；系姆恿u基數(shù)目、酚羥基連接位置、化合物空間位阻的大小等多種因素相關[16].哈薩克斯坦產地荒漠肉蓯蓉也具有很強的綜合抗氧化能力，通過化學成分分析可知，2′-乙?；锘ㄌ擒諡楣_克斯坦產地樣品中含量最高的苯乙醇苷化學成分，故推測哈薩克斯坦產地樣品的綜合抗氧化活性可能與2′-乙?；锘ㄌ擒蘸坑嘘P.本研究通過對不同產地荒漠肉蓯蓉的苯乙醇苷成分及抗氧化活性進行對比分析，為荒漠肉蓯蓉藥用資源的綜合開發(fā)與醫(yī)藥保健行業(yè)的應用提供基礎依據.

4 結論

不同產地荒漠肉蓯蓉7種苯乙醇苷成分在含量上存在明顯差異，內蒙古產地樣品中苯乙醇苷成分以松果菊苷和毛蕊花糖苷為主，而新疆與哈薩克斯坦產地樣品中苯乙醇苷成分以松果菊苷和2′-乙酰毛蕊花糖苷為主.不同產地樣品醇提物均具有良好的抗氧化活性，其綜合抗氧化能力由強到弱依次排序：內蒙古樣品>哈薩克斯坦樣品>新疆樣品.主成分分析可用于荒漠肉蓯蓉產地鑒別研究中.