馮靜茹,于立雪,田康明,牛丹丹,王正祥*

1(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院,天津,300457) 2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)

乳酸是生物體厭氧代謝的重要有機酸,存在D-乳酸和L-乳酸2種光學(xué)構(gòu)型[1]。L-乳酸已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)并應(yīng)用于食品、飼料、飲料和聚乳酸制備等行業(yè)[2]；D-乳酸也是聚乳酸、藥物合成等的重要原料[3]。由于人體不具有代謝D-乳酸的酶系,食品工業(yè)中使用的乳酸產(chǎn)品不希望有D-乳酸的存在[4]。現(xiàn)有乳酸含量測定多采用滴定法[5-6],無法區(qū)分乳酸的光學(xué)構(gòu)型。D-乳酸測定方法完全依賴配有特定分離柱的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法[7-9]。因此,實現(xiàn)對D-乳酸的快速定量分析,是研究和開發(fā)利用D-乳酸的重要內(nèi)容。

已有研究揭示,多種微生物具有以D-乳酸為唯一碳源生長的能力。這類具有代謝D-乳酸能力的微生物,通常能夠表達一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(flavine adenine dinucleotide,FAD)作為輔酶的氧化型乳酸脫氫酶,能夠催化D-乳酸氧化脫氫為丙酮酸,同時將FAD還原為黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體(flavine adenine dinucleotide,reduced,FADH2),所形成的丙酮酸則作為代謝中間體參與其生理代謝[10]。在真核微生物細胞中,FAD依賴型D-乳酸脫氫酶位于線粒體內(nèi)膜的細胞質(zhì)側(cè),是參與電子轉(zhuǎn)移的外周膜呼吸組分；在原核細胞中,此酶主要位于細胞膜的內(nèi)側(cè)[11-12]。FAD依賴型D-乳酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)與其他FAD依賴型蛋白家族最顯著的區(qū)別在于膜結(jié)合區(qū)域,有研究報道FAD依賴型D-乳酸脫氫酶的膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域呈陽性電荷表面,有6個Arg和5個Lys殘基,可能與膜上帶負電荷的磷脂頭基團相互作用,使與膜的結(jié)合是通過靜電力而非疏水力[13-14]。此外,以D-乳酸作為底物,在FAD依賴型D-乳酸脫氫酶作用下,轉(zhuǎn)移2個電子和2個質(zhì)子到電子傳遞鏈,該反應(yīng)還與細胞的各種氨基酸和糖的主動運輸有關(guān)[12,14]。

通過對大腸桿菌基因組序列分析發(fā)現(xiàn),大腸桿菌具有編碼FAD依賴型D-乳酸脫氫酶的編碼基因dld,但其性質(zhì)和功能未被解析[15]。為此,本文通過分子克隆技術(shù),對大腸桿菌dld基因進行克隆與表達,并對其表達產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)進行了分析。研究結(jié)果可為酶法定量檢測D-乳酸提供重要理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

EscherichiacoliJM109用于本研究的分子克隆與表達宿主,為本實驗室保藏；E.coliB0013為本實驗室前期分離保藏[15],用于本研究D-乳酸脫氫酶的編碼基因dld的供體；pND-113為大腸桿菌分泌表達載體[16]。

1.2 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶,寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒,Omega Bio-tec；胰蛋白胨、酵母浸粉,OXOID公司；吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT),Sigma-Aldrich；黃素腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽水合物(FAD-Na2),國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10,酵母抽提物5,NaCl 10,pH 7.0；加入20 g/L的瓊脂為固體培養(yǎng)基。

1.4 基因克隆與重組菌構(gòu)建

1.5 酶液制備、純化與鑒定

從平板上挑取2～3個大小均一的單菌落接種于50 mL液體培養(yǎng)基中,在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h,按照5%的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基,在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h,離心收集菌體。每50 mL發(fā)酵液收集到的菌體加10 mL緩沖液(含0.5%的TritonX-100)重懸,經(jīng)細胞破碎儀破碎得到細胞裂解液,12 000 r/min,離心5 min,收集上清液,即為粗酶液[17]。將粗酶液經(jīng)200～600 g/L(質(zhì)量濃度)硫酸銨分級沉淀,再經(jīng)PD-10脫鹽柱和Ni-NTA純化樹脂預(yù)裝柱進行純化,通過酶活力測定和SDS-PAGE方法分析純化情況,其中SDS-PAGE使用12%分離膠和5%濃縮膠。

1.6 酶活力測定

參照文獻[18-19]進行改進。每毫升反應(yīng)體系中包含20 mg/mL的PMS 5 μL,20 μmol/mL的FAD-Na25 μL,5 mg/mL的MTT 50 μL,1 mg/mL的D-乳酸500 μL,50 μL適當(dāng)稀釋的酶液,并用0.067 mol/L的pH 7.0的KH2PO4-K2HPO4緩沖液補足到1 mL。在35 ℃、pH 7.0的條件下反應(yīng)20 min,冰浴5 min終止反應(yīng),測定570 nm下的吸光度。以滅活酶液作為對照。酶活單位(u)定義為：在35 ℃、pH 7.0的條件下,每分鐘還原1 μmol MTT所需酶量定義為1個酶活力單位。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.7.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性

在pH 7.5,分別測定20、25、30、35、40、45、50和55 ℃下的酶活力,以最高酶活力為100%,計算其他溫度下的相對酶活力,進而確定最適反應(yīng)溫度。將酶液分別在30、35、40和45 ℃下保溫處理150 min,每隔30 min取樣,按1.6中方法測定剩余酶活力,以未經(jīng)處理的酶液酶活力為100%,確定其熱穩(wěn)定性。

1.7.2 最適pH及pH穩(wěn)定性

在最適反應(yīng)溫度下,用pH 5.0～8.5的緩沖液適當(dāng)稀釋酶液,測定對應(yīng)pH條件下的酶活力,以最高酶活力為100%,計算其他pH條件下的相對酶活力,確定酶的最適反應(yīng)pH。將酶液于不同pH 5.0～8.5、25 ℃條件下放置1 h,按1.6中方法測定殘余酶活力,以未處理的酶液酶活力為100%,確定其pH穩(wěn)定性。

1.7.3 金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑對酶活力的影響

配制不同金屬離子溶液(Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+)和化學(xué)試劑(EDTA、SDS),將酶液分別與5 mmol/L的金屬離子或化學(xué)試劑混合,按1.6中方法測定樣本酶活力,以緩沖液代替金屬離子或化學(xué)試劑作為對照,確定不同金屬離子及化學(xué)試劑對酶活力的影響。

1.7.4 底物特異性

分別以1 mg/mL的D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸、D-半乳糖醛酸、D-丙氨酸、丁二酸和α-酮戊二酸為底物,按1.6中方法測定該酶對不同底物的酶活力。

1.8 酶動力學(xué)參數(shù)測定

參照文獻[20]進行。分別以0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/mL的D-乳酸為底物,在最適反應(yīng)條件下按1.6中方法測定酶活力,采用雙倒數(shù)法作圖(Lineweaver-Burk法)并進行酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 dld的分子克隆表達與重組Dld(rDld)的制備與純化

以大腸桿菌基因組B0013為模板,通過PCR擴增獲得完整的D-乳酸脫氫酶基因片段dld,酶切后克隆入表達載體pND-113中,獲得重組表達質(zhì)粒pND-Dld。進一步采用雙脫氧核苷酸鏈終止法對其進行核苷酸序列測定與分析,dld大小為1 497 bp,編碼499個氨基酸殘基,Dld的預(yù)測分子質(zhì)量約為55 ku。經(jīng)DNAMAN和MEGA-X分析發(fā)現(xiàn),Dld氨基酸序列與來源于Achromobacter的D-乳酸脫氫酶(A0A0M7 N8L3)相似程度最高,序列一致性為100%,與Klebsiellaoxytoca(A0A181XSC2)、Raoultellaplanticola(A0A2X2EIS0)和Serratia(A0A084A2I9)的D-乳酸脫氫酶的序列一致性分別為91.3%、89.7%和67.2%,與其他來源的D-乳酸脫氫酶相似度較低(圖1)。進一步通過UniProt分析發(fā)現(xiàn),所克隆的Dld分子中的Glu468、Gln497和Ala527殘基組成其催化活性中心,Gly143、Ser150、Gly160和Val262為FAD輔酶結(jié)合位點。其中,Leu303-Lys323和Lys484-Gly504可能構(gòu)成其膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖1 大腸桿菌Dld的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenic tree of Dld from E.coli

圖2 大腸桿菌Dld的3D模擬結(jié)構(gòu)Fig.2 The mimic 3D structure of Dld from E. coli

將含有重組表達質(zhì)粒pND-Dld的菌株JM109(pND-Dld)搖瓶發(fā)酵24 h,離心收集菌體。經(jīng)細胞破碎,離心收集上清液得到粗酶液。粗酶液經(jīng)200～600 g/L(質(zhì)量濃度)硫酸銨分級沉淀,再經(jīng)PD-10脫鹽柱和Ni-NTA純化樹脂預(yù)裝柱進行純化。結(jié)果如圖3所示,純化后rDld的分子質(zhì)量約為55 ku。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品；1-粗酶液；2-純化后酶液圖3 純化后rDld的SDS-PAGE圖譜Fig.3 The SDS-PAGE profile of rDld

2.2 rDld的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適作用溫度

在pH 7.5條件下,測定20～55 ℃ rDld的酶活力,結(jié)果匯總于圖4-a。rDld的最適作用溫度為35 ℃；溫度上升到45 ℃時,相對酶活力顯著降低至71.7%；當(dāng)溫度為55 ℃時,相對酶活力僅為8.1%。

2.2.2 最適作用pH

在最適溫度下測定pH 5.0～8.5 rDld酶活力,獲得了不同pH對酶活力的影響曲線(圖4-b)。可知,rDld的最適作用pH值為7.0,pH 7.0～8.5酶活力變化較??；當(dāng)pH由7.0降低到6.5時,酶活力下降較明顯；而在pH 5.0時相對酶活力僅為15.2%。

2.2.3 熱穩(wěn)定性

將酶液在不同溫度下保溫150 min,定時取樣分析剩余酶活力,結(jié)果見圖4-c。rDld在30～40 ℃條件下孵育2 h后仍保留80%的酶活力；在45 ℃孵育0.5 h后其酶活力顯著降低,其相對酶活力僅為59.6%,孵育1 h后相對酶活力僅剩31.3%。可以看出,rDld在30～40 ℃下具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.2.4 pH穩(wěn)定性

將酶液在不同pH緩沖液中室溫放置1 h后測其剩余酶活力,結(jié)果見圖4-d。rDld在pH 7.0和pH 7.5下具有較好的穩(wěn)定性；在pH 5.0～6.5條件下保溫1 h酶活力仍在85%以上；當(dāng)在pH 8.0條件下孵育1 h,酶活力下降較明顯,剩余酶活力為75%。

a-最適作用溫度；b-最適pH；c-熱穩(wěn)定性；d-pH穩(wěn)定性圖4 rDld的最適作用溫度和pH及其穩(wěn)定性Fig.4 Optimal temperature and pH of rDld and its thermal and pH stability

2.2.5 金屬離子和化學(xué)試劑對酶活力的影響

按照1.7.3中方法研究金屬離子和化學(xué)試劑對酶活的影響,結(jié)果匯總于表1。7種常見金屬離子和2種化學(xué)試劑中,Zn2+對rDld有明顯促進作用。該性質(zhì)與文獻報道的Archaeoglobusfulgidus來源的D-乳酸脫氫酶添加Zn2+后酶活力大幅提高相類似[12]。Mn2+、Cu2+、Mg2+和SDS對rDld有明顯的抑制作用。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對酶活力的影響Table 1 Effect of metal ions and chemicals on the enzyme activity

2.2.6 底物特異性

在最適反應(yīng)溫度和pH條件下,將酶液與1 mg/mL下的D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸、D-半乳糖醛酸、D-丙氨酸、丁二酸和α-酮戊二酸反應(yīng),結(jié)果顯示,rDld的最適底物為D-乳酸；rDld對丁二酸和α-酮戊二酸呈現(xiàn)出較低活性,對L-乳酸、丙酮酸、D-半乳糖醛酸和D-丙氨酸未表現(xiàn)出活性。

表2 rDld的底物特異性Table 2 The substrate specificity of rDld

2.3 rDld的動力學(xué)特征

分別以0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/mL的D-乳酸為底物,按1.6中方法,在最適反應(yīng)條件下測定酶活。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法,以1/[S]為橫坐標(biāo),1/[V]為縱坐標(biāo),得到rDld的動力學(xué)相關(guān)特征參數(shù),其中Km值和Vmax值分別為0.057 mg/mL和0.054 μmol/(mL·min),kcat值為0.275 min-1,kcat/Km為0.435 mL/(mg·min)。

3 結(jié)論

本研究成功獲得了一種催化D-乳酸生成丙酮酸正向反應(yīng)的FAD依賴型D-乳酸脫氫酶,并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了全面分析,為D-乳酸脫氫酶的進一步研究提供了可靠生物材料,也為D-乳酸的酶法定量檢測方法的建立與應(yīng)用提供了工具。