向 雙， 陳德強(qiáng)， 孫維紅， 肖 琳， 鄒雙全，①

(福建農(nóng)林大學(xué)： a. 林學(xué)院， b. 自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心， 福建 福州 350002)

芳樟(Cinnamomumcamphoravar.linalooliferaFujita)是典型的芳香植物，其香氣的關(guān)鍵成分為芳樟醇。芳樟醇是全球最常用和消耗較多的香料之一[1]，具有多種生物活性[2-4]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)[5]，市場需求量巨大。芳樟醇可分為天然芳樟醇和合成芳樟醇2類，其中，合成芳樟醇為右旋體、具有消光性，其品質(zhì)遠(yuǎn)差于左旋體的天然芳樟醇[6]，但由于天然芳樟醇植物源提取物產(chǎn)量較低，加之芳樟自然資源有限，導(dǎo)致天然芳樟醇產(chǎn)量供應(yīng)不足，使天然芳樟醇的開發(fā)利用受到限制。通過基因工程技術(shù)對(duì)芳樟進(jìn)行改良，明確其芳樟醇合成調(diào)控基因，可為高芳樟醇芳樟品種資源的培育提供新思路和新途徑。

近年來，植物的轉(zhuǎn)錄組測序在挖掘功能基因、探明活性成分代謝通路和明確次生代謝物合成關(guān)鍵酶基因等方面得到廣泛應(yīng)用[7-8]，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)解析了黃酮類[9]、甾體皂苷類[10]和三萜類[11]等成分的生物合成途徑。本項(xiàng)目組前期研究結(jié)果表明：芳樟精油中的芳樟醇含量受多種因子的影響，不僅因品種、品系(無性系)不同而異[12-14]，也因采收時(shí)間不同而變化[15]；并且，對(duì)芳樟植株采取不同的栽培措施(例如施肥時(shí)間和肥料種類)后，其精油含量和芳樟醇含量也有明顯的差異[16-17]。而目前這些影響因子的作用機(jī)制尚不明確，特別是對(duì)芳樟醇合成過程中分子調(diào)控機(jī)制缺乏全面而深入的研究，不利于芳樟資源的進(jìn)一步開發(fā)利用。

為了明確芳樟醇合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因，探討芳樟醇合成相關(guān)基因?qū)ν庠谝蜃拥捻憫?yīng)機(jī)制，本文利用高通量測序平臺(tái)構(gòu)建芳樟葉片和枝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，對(duì)unigenes進(jìn)行功能注釋，挖掘其芳樟醇合成過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因；并以“生物炭復(fù)合肥對(duì)芳樟醇含量有影響效應(yīng)”的研究結(jié)果(另文發(fā)表)為基礎(chǔ)，比較施肥前后芳樟幼樹葉片和枝中芳樟醇含量和相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)特性的變化，以期為芳樟中芳樟醇關(guān)鍵基因克隆和功能驗(yàn)證及其品種的遺傳改良等奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為芳樟優(yōu)質(zhì)品系‘MD1’，由廈門牡丹香化實(shí)業(yè)有限公司培育，種植于福建省泉州市安溪縣半林國有林場(東經(jīng)117°57′、北緯24°55′)。樣地面積10 m×10 m，按株距1 m、行距1 m種植60株2年生幼樹；幼樹平均株高77.11 cm，平均地徑15.89 mm，平均冠幅80.95 cm。樣地為近年采伐跡地，土質(zhì)疏松，地力較肥沃，坡度較緩，適合芳樟種植。

根據(jù)項(xiàng)目組前期的研究結(jié)果確定生物炭復(fù)合肥配方，包括3.40 g生物炭(在500 ℃高溫厭氧條件下熱解玉米秸稈2 h制備)、115.00 g尿素(總N含量大于等于46.0%)、15.00 g過磷酸鈣(P2O5含量大于等于16.0%)和15.00 g氯化鉀(K2O含量大于等于60%)，其中，生物炭購自四川省久晟農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司，尿素購自安陽中盈化肥有限公司，過磷酸鈣購自甕福有限責(zé)任公司，氯化鉀購自中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料集團(tuán)公司。

1.2 方法

1.2.1 施肥處理及樣品采集 于2019年6月9日進(jìn)行施肥處理，按株施肥，每株施肥量148.40 g，均一次性施入。分別于6月9日施肥前以及7月9日、9月9日和11月9日(即施肥后第1、第3和第5個(gè)月)采集無病蟲害的當(dāng)年生葉片和枝，在樣株東、南、西、北4個(gè)方位分別采集葉片和枝，各自混合裝袋，每袋100 g，每份樣品3袋，記為3次重復(fù)，用于精油提取和芳樟醇含量測定。轉(zhuǎn)錄組分析樣品用5 mL凍存管收集，每份樣品3管，記為3次重復(fù)，置于-80 ℃下保存、備用。

1.2.2 精油提取和芳樟醇相對(duì)含量測定 采用水蒸氣蒸餾法[18]提取芳樟葉片和枝的精油，并采用HPLC法測定精油中芳樟醇的相對(duì)含量。

精密稱取43.5 mg芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)78-70-6，純度在97%及以上，購自美國Acros Organics公司)，加入甲醇(色譜純，德國Merck公司)溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度4.35 mg·mL-1的芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液；分別吸取2、4、6、8、10和12 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按下述色譜條件進(jìn)行檢測。色譜條件：Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Dikma Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=70∶30混合液，等度洗脫，流速1 mL·min-1；檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。記錄色譜圖，并以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)(y)、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=(6×108)x+61 162(R2=0.999 9，線性范圍為4.35～52.20 μg)。

稱取100 g葉片或枝，于50 ℃烘干至含水率5%～13%，粉碎后置于500 mL揮發(fā)油提取器中，加入200 mL超純水加熱提取60～90 min，蒸餾后取上層精油，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后稱量，按照公式“芳樟精油提取率=芳樟精油質(zhì)量/樣品鮮質(zhì)量×100%”計(jì)算芳樟精油提取率。精密稱取各精油樣品45 mg，用甲醇定容至10 mL，過濾，濾液即為供試樣品溶液；按照上述色譜條件進(jìn)樣測定，每份樣品測定3次，記錄各樣品中芳樟醇的峰面積。

根據(jù)芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品中芳樟醇的峰面積，按照公式“芳樟醇相對(duì)含量=(樣品溶液中芳樟醇的峰面積/芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積)×(芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品的濃度/樣品溶液的濃度)×100%”計(jì)算樣品中芳樟醇的相對(duì)含量。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序與組裝 根據(jù)精油提取率和芳樟醇相對(duì)含量測定結(jié)果，以施肥前及施肥后第3個(gè)月的葉片和枝為材料，用RNA試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司)提取總RNA；用NanoDrop微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)檢測其純度，并用Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent Technology公司)檢測其濃度和完整性。

隨后，用Oligo(dT)磁珠從總RNA中分離和純化mRNA，并在富集后進(jìn)行片段化處理，用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模版合成cDNA，將cDNA片段末端修復(fù)，構(gòu)建芳樟轉(zhuǎn)錄組的cDNA文庫。用DNBSEQ高通量測序平臺(tái)(武漢華大基因科技有限公司)對(duì)檢測合格的cDNA文庫進(jìn)行測序；過濾低質(zhì)量、接頭污染及未知堿基N含量過高的reads，得到高質(zhì)量reads；用Trinity軟件[19]對(duì)高質(zhì)量reads進(jìn)行從頭組裝，并用TGICL軟件[20]將組裝后的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余，最終得到unigenes。

1.2.4 Unigenes功能注釋 用NCBI BLASTx軟件[21]將unigenes與NR(NCBI非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫)、NT(核酸序列數(shù)據(jù)庫)、Swiss-Prot(經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫)、Pfam(蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫)、GO(基因本體數(shù)據(jù)庫)、KEGG(京都基因與基因組百科全書)和KOG(真核生物直系同源基因數(shù)據(jù)庫)7個(gè)數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)unigenes進(jìn)行功能注釋、預(yù)測和分類。

1.2.5 基因表達(dá)特性分析 用Bowtie2軟件[22]分別對(duì)芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行序列比對(duì)，并用RSEM軟件計(jì)算基因的表達(dá)水平，得到每個(gè)unigene的表達(dá)水平(FPKM)。用DESeq2軟件[23]，根據(jù)篩選條件“閾值為|log2FC|>1”和“錯(cuò)誤率(FDR)小于0.01”，對(duì)與芳樟醇合成有關(guān)的調(diào)控基因進(jìn)行篩選，并對(duì)各基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

用EXCEL 2017軟件對(duì)芳樟轉(zhuǎn)錄組unigenes數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并制圖，用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行方差分析，采用Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序和組裝及unigenes功能注釋

2.1.1 轉(zhuǎn)錄組測序和組裝結(jié)果 通過DNBSEQ測序平臺(tái)，從芳樟葉片和枝的轉(zhuǎn)錄組中共獲得72 560個(gè)unigenes，平均長度為1 330 bp，unigenes總長度達(dá)到96 543 844 bp，N50值為2 054 bp，GC含量為43.19%。

由unigenes長度分布數(shù)據(jù)(表1)可見：在72 560個(gè)unigenes中，長度小于300 bp的unigenes有12 086個(gè)，僅占unigenes總數(shù)的16.7%；長度3 000 bp以上的unigenes有6 441個(gè)，長度大于1 000 bp的unigenes數(shù)占unigenes總數(shù)的49%以上，表明芳樟葉片和枝的轉(zhuǎn)錄組序列完整性較高，可用于unigenes功能注釋。

表1 芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組unigenes的長度分布1)

2.1.2 Unigenes功能注釋結(jié)果 對(duì)獲得的芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組unigenes進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋，結(jié)果顯示：在72 560個(gè)unigenes中，共有52 613個(gè)unigenes被注釋到7個(gè)數(shù)據(jù)庫中，占unigenes總數(shù)的72.51%。其中，在NR數(shù)據(jù)庫中注釋到50 149個(gè)unigenes，占unigenes總數(shù)的69.11%，是注釋unigenes數(shù)最多的數(shù)據(jù)庫；分別有36 090、39 232、40 698、40 096、39 995、39 186 個(gè)unigenes注釋到NT、Swiss-Prot、KEGG和KOG、Pfam和GO 6個(gè)數(shù)據(jù)庫中，注釋的unigenes數(shù)分別占unigenes總數(shù)的49.74%、54.07%、56.09%、55.26%、55.12%和54.00%。同時(shí)注釋到7個(gè)數(shù)據(jù)庫的unigenes數(shù)有21 055個(gè)，占unigenes總數(shù)的29.02%。

2.1.2.1 序列相似性分析 將芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組unigenes與NR數(shù)據(jù)庫中一些植物轉(zhuǎn)錄組unigenes進(jìn)行序列相似性比較。結(jié)果顯示：芳樟與荷花(NelumbonuciferaGaertn.)的同源序列匹配度最高，相似序列比例達(dá)到27.09%；其次為博落回〔Macleayacordata(Willd.) R. Br.〕，相似序列比例為14.91%；與葡萄(VitisviniferaLinn.)、油棕(ElaeisguineensisJacq.)和海棗(PhoenixdactyliferaLinn.)的同源序列匹配度也較高，相似序列比例分別為5.85%、5.43%和3.95%；與其他植物的同源序列匹配度均較低，這部分序列比例為42.76%。

2.1.2.2 GO注釋分析 在GO數(shù)據(jù)庫對(duì)芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組unigenes功能進(jìn)行注釋，結(jié)果見圖1。

由圖1可見：共有39 186個(gè)unigenes注釋到生物過程(biological process)、細(xì)胞成分(cellular component)和分子功能(molecular function)3大類24亞類中，其中注釋到分子功能的unigenes最多。在注釋到生物過程類別的21 993個(gè)unigenes中，注釋到細(xì)胞過程(cellular process)的unigenes最多，有9 520個(gè)；在注釋到細(xì)胞成分類別的28 829個(gè)unigenes中，注釋到膜部分(membrane part)的unigenes最多，有12 323個(gè)；而在注釋到分子功能類別的44 405個(gè)unigenes中，注釋到結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)的unigenes較多，分別有20 456和18 905個(gè)。

： 生物過程Biological process； ： 細(xì)胞成分Cellular component； ： 分子功能Molecular function.圖1 芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組unigenes的GO功能分類結(jié)果Fig. 1 Result of GO function classification of unigenes in transcriptomes from leaf and branch ofCinnamomum camphora var. linaloolifera Fujita

2.1.2.3 KEGG代謝途徑分析 通過KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組unigenes功能進(jìn)行注釋，結(jié)果見圖2。

由圖2可見：共有40 698個(gè)unigenes注釋到細(xì)胞過程(cellular process)、環(huán)境信息處理(environment information processing)、遺傳信息加工(genetic information processing)、代謝(metabolism)和生物系統(tǒng)(organismal system)相關(guān)的代謝通路中，共5大類19亞類，且主要集中在代謝和遺傳信息處理2大類中。

： 細(xì)胞過程Cellular process； ： 環(huán)境信息處理Environment information processing； ： 遺傳信息加工Genetic information processing； ： 代謝Metabolism； ： 生物系統(tǒng)Organismal system.圖2 芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組unigenes的KEGG功能分類結(jié)果Fig. 2 Result of KEGG function classification of unigenes in transcriptomes from leaf and branch ofCinnamomum camphora var. linaloolifera Fujita

注釋到細(xì)胞過程類別的所有unigenes均注釋到運(yùn)輸與分解代謝(transport and catabolism)亞類中，共有1 808個(gè)unigenes。注釋到環(huán)境信息處理類別的unigenes共有2 923個(gè)，其中注釋到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)亞類的unigenes較多，有2 470個(gè)。注釋到遺傳信息加工類別的unigenes共有8 829個(gè)，其中注釋到翻譯(translation)亞類的unigenes最多，有3 553個(gè)。注釋到代謝類別的unigenes共有23 363個(gè)，其中注釋到全局和概述地圖(global and overview map)亞類的unigenes最多，有8 972個(gè)。注釋到生物系統(tǒng)類別的所有unigenes均注釋到環(huán)境適應(yīng)性(environmental adaptation)亞類中，共有2 057個(gè)。

芳樟醇主要通過MEP(甲基赤蘚醇磷酸)途徑合成前體物質(zhì)，因此，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，篩選出與芳樟醇合成相關(guān)的基因及其對(duì)應(yīng)的酶，并推測芳樟芳樟醇的合成途徑。結(jié)果顯示：DXS(1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶)催化丙酮酸和3-磷酸甘油醛生成DXP(1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸)，是芳樟醇合成的第1個(gè)限速酶；隨后DXR(1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶)催化DXP生成2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸，并在CMS(2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶)、CMK〔4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶〕、MDS(2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2，4-環(huán)二磷酸合成酶)、HDS(4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸合成酶)、HDR(4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸還原酶)和GPPS(牻牛兒基焦磷酸合酶)等一系列酶的作用下合成GPP(牻牛兒基二磷酸)，最后在LIS(芳樟醇合酶)的作用下生成芳樟醇。

2.1.2.4 KOG功能預(yù)測結(jié)果 通過KOG數(shù)據(jù)庫對(duì)芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組unigenes的功能進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見圖3。

由圖3可見：共有40 096個(gè)unigenes注釋到24個(gè)KOG類別中。其中，注釋到一般功能預(yù)測(general function prediction only)的unigenes有9 104個(gè)，數(shù)量最多，說明功能預(yù)測是芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組中最主要的功能分類。另外，注釋到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signal transduction mechanism)功能的unigenes有5 352個(gè)，注釋到翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶(posttranslational modification，protein turnover and chaperone)功能的unigenes有3 182個(gè)，注釋到轉(zhuǎn)錄(transcription)功能的unigenes有2 544個(gè)，注釋到RNA加工和修飾(RNA processing and modification)功能的unigenes有1 522個(gè)，注釋到次生代謝產(chǎn)物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝(secondary metabolites biosynthesis， transport and catabolism)功能的unigenes有1 043個(gè)。上述unigenes也是芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組較為重要的基因。

圖3 芳樟葉片和枝轉(zhuǎn)錄組unigenes的KOG功能分類結(jié)果Fig. 3 Result of KOG function classification of unigenes in transcriptomes from leaf and branch of Cinnamomum camphora var. linaloolifera Fujita

2.2 施肥后芳樟醇相對(duì)含量及其合成調(diào)控基因表達(dá)水平的變化

2.2.1 芳樟醇相對(duì)含量的變化 施肥前后芳樟葉片和枝中芳樟醇相對(duì)含量的變化見表2。比較結(jié)果顯示：不論是施肥前還是施肥后，葉片中芳樟醇相對(duì)含量均高于枝，但差異幅度不大。但施肥后不同時(shí)間葉片和枝中芳樟醇相對(duì)含量均高于施肥前，差異均達(dá)顯著(P<0.05)水平；并在施肥后第3個(gè)月葉片和枝中芳樟醇相對(duì)含量均達(dá)到最高，分別為89.89%和84.83%，但在施肥后第5個(gè)月葉片和枝中芳樟醇相對(duì)含量則顯著下降。

表2 施肥前后芳樟葉片和枝芳樟醇相對(duì)含量變化

2.2.2 芳樟醇合成調(diào)控基因及其表達(dá)水平變化 結(jié)合芳樟葉片和枝中芳樟醇的代謝途徑，進(jìn)一步篩選關(guān)鍵調(diào)控基因，并對(duì)施肥前后各基因的表達(dá)水平(FPKM)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

由表3可見：從施肥前芳樟葉片和枝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定出23個(gè)與芳樟醇合成相關(guān)的基因，其中，15個(gè)基因在枝中的表達(dá)水平高于葉片，8個(gè)基因在葉片中的表達(dá)水平高于枝，說明在芳樟不同部位這些基因的表達(dá)具有組織特異性。

由表3還可見：與施肥前相比，施肥后第3個(gè)月葉片中有18個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)，枝中有15個(gè)基因的表達(dá)水平上調(diào)，葉片和枝中均上調(diào)表達(dá)的基因有13個(gè)，包括3個(gè)DXS基因(DXS1、DXS3和DXS6)、1個(gè)DXR基因、2個(gè)HDS基因(HDS1和HDS2)、1個(gè)HDR基因(HDR2)、2個(gè)IDI基因(IDI1和IDI2)、1個(gè)GPPS基因(GPPS1)和3個(gè)LIS基因(LIS1、LIS2和LIS4)；另外，雖然施肥后葉片中CMS和GPPS2基因以及枝中CMK、MDS和IDI3基因的表達(dá)水平下調(diào)，但這些基因的總體表達(dá)水平較高，表明這些基因都可能參與芳樟醇合成的調(diào)控。

表3 施肥前和施肥后第3個(gè)月芳樟葉片和枝中芳樟醇合成調(diào)控基因表達(dá)水平(FPKM)的變化

在施肥前后，葉片中MDS和IDI2基因以及枝中GPPS1基因的表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)，表明施用生物炭復(fù)合肥可能對(duì)這些基因的表達(dá)有一定的影響。且這些基因表達(dá)水平均上調(diào)，表明施用生物炭復(fù)合肥可能對(duì)基因表達(dá)有促進(jìn)作用。而其他基因盡管在施肥前后表達(dá)水平差異不顯著，但也出現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào)，表明施用生物炭復(fù)合肥對(duì)這些基因的影響較小。

3 討論和結(jié)論

上述高通量測序結(jié)果表明：從芳樟葉片和枝的轉(zhuǎn)錄組中共獲得72 560個(gè)unigenes，平均長度1 330 bp，N50值為2 054 bp，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)較為完整，基因信息較為豐富；而江香梅等[24]對(duì)5種化學(xué)型樟樹葉片轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，共獲得55 955個(gè)unigenes，平均長度584 bp， N50值為1 023 bp，造成這一差異的原因可能與轉(zhuǎn)錄組的來源器官、株齡以及栽培措施和生境條件等因子有關(guān)。本研究結(jié)果表明：通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，芳樟葉片和枝的轉(zhuǎn)錄組中有40 698個(gè)unigenes被注釋到5大類19亞類代謝途徑中，涵蓋了多糖、甾體皂苷、萜類和苯丙素類等生物合成相關(guān)基因。其中，注釋到萜類和聚酮化合物代謝的有603個(gè)unigenes，明顯少于花生(ArachishypogaeaLinn.)轉(zhuǎn)錄組(1 033個(gè))[25]，可能與花生的萜類和聚酮化合物比芳樟更豐富有關(guān)。

萜類化合物合成途徑分為MEP和MVA(甲羥戊酸)兩類途經(jīng)[26]，其中MEP途徑主要合成單萜和二萜及類胡蘿卜素和葉綠素等多萜類化合物，MVA途徑主要合成倍半萜和甾醇等三萜類化合物。芳樟醇是單萜醇，主要通過MEP途徑生成前體物質(zhì)GPP，然后在LIS的作用下生成芳樟醇；芳樟醇是桂花〔Osmanthusfragrans(Thunb.) Loureiro〕[27]、夜來香〔Telosmacordata(Burm. F.) Merr.〕[28]和小蒼蘭(FreesiarefractaKlatt)[29]等芳香植物的特征香氣成分之一，也是芳樟葉片和枝精油的重要成分之一。本研究鑒定出23個(gè)與芳樟醇合成相關(guān)的基因，其中，15個(gè)基因在枝中表達(dá)水平高于葉片，8個(gè)基因在葉片中表達(dá)水平高于枝，揭示出這些基因在芳樟中的表達(dá)具有組織特異性。枝中有15個(gè)基因的表達(dá)水平高于葉片，但枝中的芳樟醇含量反而低于葉片，推測這15個(gè)基因?qū)Ψ颊链己铣烧{(diào)控的影響作用小于在葉片中表達(dá)較高的8個(gè)基因。DXS是芳樟萜類合成中第1個(gè)限速酶[30]，在擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕[31]、銀杏(GinkgobilobaLinn.)[32]和番茄(LycopersiconesculentumMiller)[33]等植物中，DXS基因過量表達(dá)可使各種單萜類化合物產(chǎn)量顯著提高。而在芳樟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，2個(gè)DXS基因表達(dá)水平較低，并且施肥后芳樟醇相對(duì)含量提高，3個(gè)DXS基因表達(dá)水平也上調(diào)，因此，可以通過調(diào)控DXS基因的表達(dá)水平改變芳樟醇含量。在芳樟葉片和枝的轉(zhuǎn)錄組中，盡管施肥后LIS1、LIS3和LIS4這3個(gè)基因的表達(dá)水平有所上調(diào)，但4個(gè)LIS基因的表達(dá)水平總體上仍較低，說明LIS基因也是芳樟醇合成的限速酶。值得注意的是，楊艷萍[34]認(rèn)為DXR是萜類合成中的第2個(gè)限速酶，但本研究結(jié)果則顯示：在施肥前后芳樟葉片與芳樟醇合成相關(guān)的調(diào)控基因中，DXR基因的表達(dá)水平均最高，且在施肥后枝中該基因的表達(dá)水平也升至最高，推測DXR基因參與芳樟芳樟醇合成過程的調(diào)控，但并不起限速作用，這種現(xiàn)象可能與DXR基因的表達(dá)具有種類特異性有關(guān)[30]。

芳樟醇的形成、積累和轉(zhuǎn)化過程非常復(fù)雜，受到遺傳和環(huán)境因子的綜合影響。黃秋良等[35]的研究結(jié)果表明：施用微生物菌劑能夠促進(jìn)芳樟生長和精油積累；而在本研究中，施用生物炭復(fù)合肥也可顯著提高芳樟葉片和枝中芳樟醇的相對(duì)含量，說明施用合適的肥料對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物合成有一定的促進(jìn)作用。芳樟葉片和枝中的芳樟醇相對(duì)含量在施肥后第3個(gè)月達(dá)到最高，在施肥后第5個(gè)月不同程度下降，這一現(xiàn)象可能與氣溫變化及芳樟生長期有關(guān)。施肥后第3個(gè)月正好是9月中旬，氣溫開始下降，植株即將進(jìn)入一個(gè)生長周期的末期，生長和生理代謝速率均減緩，使芳樟醇的合成同步減緩。并且，施肥后芳樟葉片和枝中的芳樟醇相對(duì)含量提高，多數(shù)基因的表達(dá)水平也不同程度上調(diào)，尤其是葉片中的MDS和IDI2基因以及枝中的GPPS1基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明施用生物炭復(fù)合肥可能對(duì)這些基因的表達(dá)有一定的影響。

綜上所述，施用生物炭復(fù)合肥后，芳樟葉片和枝中芳樟醇的相對(duì)含量均顯著提高，多數(shù)基因表達(dá)水平也不同程度上調(diào)，說明生物碳復(fù)合肥可能影響芳樟醇合成調(diào)控基因的表達(dá)特性，從而影響芳樟醇含量，但其中關(guān)鍵基因的功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。