肖中華

江西省撫州市樂安縣人民醫(yī)院檢驗科，江西撫州 344300

隨著我國社會經濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率及患病率逐年升高，嚴重威脅我國人民的健康。糖化血紅蛋白(HbA1c)可反映受檢者檢測前120 d內的平均血糖水平，能準確反映糖尿病患者長期的血糖控制水平，且不受采血時間、是否空腹、是否使用胰島素等因素干擾。在美國、歐盟、澳洲及日本等國家和地區(qū)已將HbA1c列為糖尿病的診斷和監(jiān)測指標，在我國其被推薦用于糖尿病診斷及診斷標準的相關研究[1-2]。同時也有研究報道，將HbA1c與其他項目聯(lián)合檢測用于相關疾病的診斷、鑒別與療效評估具有較高的應用價值[3-4]。熒光免疫層析法作為HbA1c檢測方法之一，因其融合了膠體金免疫層析技術的定量檢測方法，具有操作簡單、攜帶方便、檢測速度快等優(yōu)點[5-6]，已被當作床旁檢測(POCT)項目廣泛應用于各基層醫(yī)院實驗室及病房，但其不需要專業(yè)人員操作就可以得出檢測結果，容易因操作不規(guī)范，從而影響檢測結果的準確性。筆者通過熒光免疫層析法對不同HbA1c水平標本進行檢測，檢測過程中對各步驟設置不同時間，發(fā)現(xiàn)不同HbA1c水平標本加入標本稀釋液后混合作用不同時間的檢測結果，以及標本稀釋混合液加入檢測板后在不同時間進行檢測的結果均存在一定的差異，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 (1)質控品2份：水平1(批號191018，靶值5.0%)和水平2(批號191018，靶值9.7%)質控品均由廣州萬孚生物技術股份有限公司提供。(2)收集15份糖尿病患者乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝全血標本(2～8 ℃保存7 d內的患者標本，標本的HbA1c水平取值于按標本按試劑盒說明書標準操作程序檢測2次的均值)，其中HbA1c<6%的標本5份(設為HbA1c低值組)，HbA1c為6%～10%的標本5份(設為HbA1c中值組)，HbA1c>10%的標本5份(設為HbA1c高值組)。

1.2儀器與試劑 萬孚飛測Ⅲplus免疫熒光檢測儀、HbA1c檢測試劑盒(熒光免疫層析法，批號：W20714606A)均購自廣州萬孚生物技術股份有限公司。

1.3檢測方法 (1)方法A：嚴格按照HbA1c檢測試劑盒說明書進行標準操作，取試劑、標本在室溫下平衡，取10 μL血液標本加入標本稀釋液中混勻作用1 min后，取75 μL標本稀釋混合液加入檢測板，5 min后立即進行檢測。依次對定值質控品水平1、水平2及15份不同HbA1c水平的全血標本進行檢測，并記錄結果作為對照。(2)方法B：將上述試劑盒說明書標準操作步驟中的標本與稀釋液作用時間，設置為不同時間再分別按作用時間吸樣加入檢測板作用5 min后立即檢測，記錄結果，并與標準操作(方法A)檢測結果進行比較。(3)方法C：按說明書標準操作步驟制備標本，與稀釋液混合作用1 min的標本混合液加入檢測板，設置不同檢測時間進行檢測，記錄結果，并與標準操作(方法A)檢測結果進行比較。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理及統(tǒng)計分析。不同步驟作用時間之間檢測結果采用單變量方差分析法進行比較；不同HbA1c水平分組之間的檢測結果先與樣品水平標示值比較算出偏倚值(取其絕對值)，再將偏倚值進行單變量方差分析法比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1方法A與方法B檢測不同水平HbA1c的結果比較 (1)標本加入稀釋液混合作用1 min (標準操作)檢測結果與混合作用3、5 min檢測結果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與混合作用10～60 min檢測結果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)質控品水平1與HbA1c低值組、HbA1c中值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與HbA1c高值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(3)質控品水平2與HbA1c低值組、HbA1c中值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與HbA1c高值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)HbA1c低值組與HbA1c中值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與HbA1c高值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(5) HbA1c中值組與HbA1c高值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。具體作用時間及檢測結果見表1，HbA1c低值組、HbA1c中值組、HbA1c高值組和不同水平質控品偏倚值結果見表2。

表1 各標本分別用方法A和方法B檢測的HbA1c水平(%)

表2 方法B檢測HbA1c水平與樣品水平標示值比較的偏倚值(%)

2.2方法A與方法C檢測不同水平HbA1c的結果比較 (1) 標本稀釋混合液加入檢測板后5 min (標準操作)檢測結果與加入檢測板后10、15、20 min檢測結果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與加入檢測板后25、30、60 min檢測結果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)質控品水平1與HbA1c低值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與HbA1c中值組、HbA1c高值組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(3)質控品水平2與HbA1c中值組、HbA1c高值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與HbA1c低值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)HbA1c低值組、HbA1c中值組、HbA1c高值組間偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(5) 質控品水平1與水平2 偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。具體檢測時間及檢測結果見表3，HbA1c低值組、HbA1c中值組、HbA1c高值組和不同水平質控品偏倚值結果見表4。

表3 各標本分別用方法A和方法C檢測HbA1c水平(%)

表4 方法C檢測HbA1c水平與樣品水平標示值比較的偏倚值(%)

3 討 論

熒光免疫層析法是利用熒光免疫技術，結合層析法和免疫法的特點，采用夾心法檢測HbA1c在人體血液中的百分比。檢測原理：標本中的HbA1c、血紅蛋白(Hb)分別與包被在硝酸纖維素膜上的熒光標記HbA1c單克隆抗體、熒光標記Hb單克隆抗體結合，在層析作用下反應復合物沿著硝酸纖維素膜向前擴散，被固定在硝酸纖維素膜檢測線上包被的HbA1c抗體、Hb抗體結合，血液標本中的HbA1c抗原、血紅蛋白(Hb)抗原水平與熒光信號強度呈正相關，通過熒光檢測儀檢測熒光信號強弱計算得出HbA1c占Hb的比值[3-6]。

大量的文獻對國內HbA1c的檢測方法和分析儀器進行比較[6-11]，并對HbA1c的檢測現(xiàn)狀進行了闡述，其中高效液相色譜法被認為是檢測HbA1c最穩(wěn)定和準確的參考方法。有研究者用其他方法與高效液相色譜法進行對比分析，其中曹東林等[5]和ANG等[6]都對熒光免疫層析法與高效液相色譜法進行了比較，發(fā)現(xiàn)二者檢測結果有較好的一致性。

本研究結果顯示，熒光免疫層析法在檢測全血標本HbA1c的過程中，標本與標本稀釋液混合作用時間在1～5 min內進行檢測，對檢測結果無影響(P>0.05)，作用時間延長至10 min以后，HbA1c水平越高的標本隨著標本稀釋液作用時間的延長，檢測結果逐漸降低，與標準操作(1 min)檢測結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這可能與標本稀釋液中含有十二烷基硫酸鈉(SDS)有關，SDS是一種陰離子表面活性劑，可使紅細胞膜崩解，釋放Hb(含HbA1c)，當其與Hb作用一定時間后，可能也會改變Hb的構象，其抗原性也相應發(fā)生改變，但真正的原因有待進一步做相關研究來證實。有相關研究報道，一定水平的SDS與Hb作用后，可使Hb變性，空間結構發(fā)生變化，隨著SDS溶液水平的增加，蛋白質去折疊的程度加大，構型發(fā)生進一步變化[10-11]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，標本稀釋混合液加入熒光免疫層析檢測板后作用 5～20 min內進行檢測，對檢測結果無影響(P>0.05)，檢測時間延長至25 min以后，HbA1c水平越高的標本隨著檢測時間的延長，檢測結果也逐漸降低，與標準操作(5 min)檢測結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這應該與熒光強度隨時間的延長而自然衰減有關。

綜上所述，熒光免疫層析法以其不需要昂貴設備、操作簡單、攜帶方便、檢測速度快等優(yōu)點為基層醫(yī)院開展HbA1c檢測帶來了便利，但在檢測過程中應嚴格遵守操作標準，并在合理的時間內完成檢測，否則可能造成檢測結果不準確，對臨床疾病的診斷和治療無參考價值，甚至誤導臨床，延誤患者病情，嚴重者可能危及患者生命。