王鈺清，葛 銳，姚 珂，張魯中，楊宇民

（南通大學(xué) 教育部/江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001)

目前對于性能優(yōu)良的組織工程生物材料支架來說，生物材料的可降解性是材料學(xué)不可忽略的問題[1]。在臨床醫(yī)學(xué)研究中，不可降解材料在體內(nèi)易對患者增加二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找一種既有適宜降解速度又能發(fā)揮其功能的生物材料顯得尤為重要[2]。這類生物材料將生物活性材料與可降解材料這兩個(gè)獨(dú)立的概念結(jié)合起來，旨在可降解材料上進(jìn)行分子修飾，與細(xì)胞整合素結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)合成與組裝，從而啟動機(jī)體的再生系統(tǒng)，促進(jìn)組織再生[3]。

絲素蛋白是自然界最豐富且來源最為廣泛的生物材料之一，具有生物相容性好、力學(xué)性能優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)[4]。此外，絲素蛋白還具有可加工性，可用作各種形式的生物材料，如薄膜[5-6]、凝膠[7]等。絲素蛋白被廣泛認(rèn)為是生物相容性好，但分類為不可降解生物材料，絲素在植入體內(nèi)1 年后會失去主要的拉伸性能[8]。體外實(shí)驗(yàn)[9]表明蛋白質(zhì)酶可切斷絲素蛋白非晶區(qū)域鏈段，使其分解為多肽而被細(xì)胞進(jìn)一步代謝。但目前還未有相關(guān)報(bào)道闡明純絲素蛋白支架在體內(nèi)是否真正具有降解趨勢，理論上講其在體內(nèi)降解是一個(gè)非常漫長的過程，這也是其被認(rèn)定為不可降解材料的主要原因。經(jīng)過不斷的研究，可以通過制備較小分子質(zhì)量的絲素蛋白從而加快絲素蛋白在體內(nèi)的降解速度。但是小分子質(zhì)量絲素蛋白支架在體內(nèi)加快降解的同時(shí)，也降低了絲素蛋白自身的機(jī)械性能。絲素蛋白支架機(jī)械性能較低時(shí)，在手術(shù)縫合時(shí)縫合線的拉扯可能導(dǎo)致支架的結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生變化，從而降低支架在體內(nèi)的修復(fù)效率。因此如何讓小分子質(zhì)量絲素蛋白在體內(nèi)保持良好的機(jī)械性能是主要問題之一。

本研究擬選取課題組制備的分子質(zhì)量約為100 ku和50 ku 的兩種小分子質(zhì)量絲素蛋白[10]，在此基礎(chǔ)上制備了兩種小分子質(zhì)量的復(fù)合型絲素導(dǎo)管。這兩種導(dǎo)管分別被用于植入大鼠體內(nèi)用于修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損以及被植入兔子背部皮下用于觀察絲素蛋白導(dǎo)管在體內(nèi)的降解行為，將為絲素蛋白在外周神經(jīng)領(lǐng)域的可調(diào)控降解與再生修復(fù)能力提供科學(xué)的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 桑蠶絲（南通仙基達(dá)繭絲制品有限公司)；戊巴比妥鈉、神經(jīng)絲（neurofilament，NF)蛋白抗體（NF 160/200 antibody)、聚乙二醇辛基苯基醚（Sigma 公司，美國)；S100 β 蛋白抗體、山羊抗兔IgG H&L（488)、山羊抗鼠IgG H&L（488)、山羊抗兔IgG H&L（cy3)、山羊抗鼠IgG H&L（cy3)（Abcam 公司，上海)；免疫熒光封閉液、蘇木精-伊紅染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS)（CORNING 公司，美國)；JEM-1230 透射電子顯微鏡（HITACHI 公司，日本)；ZEISSAX10 正置研究級光學(xué)顯微鏡（ZEISS 公司，德國)；冰凍切片機(jī)（Leica 公司，德國)；冷凍干燥機(jī)（VirTis 公司，美國)。

1.2 不同分子質(zhì)量復(fù)合型絲素導(dǎo)管的制備 （1)不同分子質(zhì)量絲素蛋白溶液制備:參考L.Z.ZHANG等[1]的方法制備不同分子質(zhì)量的絲素蛋白溶液，得到分子質(zhì)量約為100 ku（SF30)和50 ku（SF180)的兩種小分子質(zhì)量絲素蛋白。（2)不同分子質(zhì)量復(fù)合型絲素導(dǎo)管的制備:①將制備的兩種分子質(zhì)量的絲素蛋白溶液分別在冷凍干燥機(jī)上凍干；②在直徑為2 mm的金屬導(dǎo)管模具上進(jìn)行靜電紡絲8 h，完成后將導(dǎo)管浸泡在無水乙醇中4 h，晾干并用實(shí)驗(yàn)室自制的編織機(jī)編上一層絲素線；③將凍干機(jī)上凍干的兩種分子質(zhì)量的絲素蛋白取出，分別配制25%甲酸絲素涂層溶液，均勻涂抹在相應(yīng)的金屬導(dǎo)管上，放入60 ℃烘箱烘2 h；④重復(fù)上述涂層步驟繼續(xù)烘干，二次烘干完成后將導(dǎo)管浸泡在70%乙醇溶液中數(shù)天取下，所得導(dǎo)管標(biāo)記為SF30 和SF180。

1.3 體內(nèi)降解檢測 通過構(gòu)建兔子模型進(jìn)行體內(nèi)降解檢測。成年雄性新西蘭大耳白兔，體質(zhì)量（2.2±0.5) kg，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將干燥的導(dǎo)管剪成1 cm 的小段，并進(jìn)行編號、稱重，此時(shí)導(dǎo)管的初始重量記為m1，滅菌待用。模型制備:將兔子深度麻醉后，背部進(jìn)行剃毛并用碘附消毒，背部剪開6 個(gè)小孔，將導(dǎo)管依次進(jìn)行皮下植入，并對兔子進(jìn)行編號。模型制備完成后10、20、30、90、180 d 進(jìn)行取材，之后輕輕剝?nèi)?dǎo)管外側(cè)和內(nèi)側(cè)的組織，清洗干凈后放入烘箱烘干至恒重，并稱重，此時(shí)每根導(dǎo)管的重量記為m2，降解率/%=（m1-m2)/m1×100。本實(shí)驗(yàn)方案獲南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（S20181201-303)。

1.4 大鼠坐骨神經(jīng)缺損橋接模型的制備 成年Sprague-Dawley（SD)大鼠，體質(zhì)量為200 g，雄性，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將92 只SD 大鼠隨機(jī)分成4 組，即缺損組、自體組、SF30 組和SF180 組。每組再分1、4、8、12 周4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)。將大鼠腹腔麻醉，予左側(cè)下肢剃毛，用碘附對剃毛處進(jìn)行消毒。暴露大鼠坐骨神經(jīng)，制備各組模型:缺損組，將大鼠坐骨神經(jīng)剪去約1 cm 的坐骨神經(jīng)段，不處理神經(jīng)立即縫合肌肉和皮膚；自體組，將大鼠坐骨神經(jīng)剪去1 cm，對神經(jīng)的兩斷端進(jìn)行縫合，隨后縫合肌肉和皮膚；兩種分子質(zhì)量的導(dǎo)管組:將大鼠坐骨神經(jīng)剪去1 cm，取長度約為1 cm 的導(dǎo)管，將神經(jīng)的兩斷端搭在導(dǎo)管的兩端進(jìn)行縫合，隨后縫合肌肉和皮膚。模型制備完成后按上述時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行灌注取材，并做后續(xù)的指標(biāo)分析。本實(shí)驗(yàn)方案獲南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（S20180805-304)。

1.5 蘇木精-伊紅染色 將導(dǎo)管和坐骨神經(jīng)按照1、4、8、12 周的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材后，縱切導(dǎo)管，制備冰凍切片，厚度為12 μm。用雙蒸水洗滌切片，蘇木精染色20 min；用0.5%鹽酸乙醇分色，在流水下藍(lán)化20 min；然后用伊紅染色60 s，隨后浸泡于50%、70%、80%、90%和無水乙醇中梯度脫水，5 min/次；再浸泡于乙醇和二甲苯（1∶1 體積比)混合溶液中5 min；最后置于二甲苯溶液中洗滌3 次，用中性樹脂封片，吹干用蔡司顯微鏡拍照觀察。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 用PBS 清洗切片數(shù)次，免疫熒光封閉液封閉1 h；再用PBS 清洗3 次，10 min/次；4 ℃冰箱中孵育一抗（1∶400)過夜；第2 天洗去一抗，用PBS 清洗3 遍，10 min/次；然后孵育二抗488（1∶400)和cy3（1∶400)，室溫孵育3 h；PBS 洗滌3 次，加入封片液封片，并用蔡司顯微鏡拍照。

1.7 透射電鏡檢測 術(shù)后3 個(gè)月對大鼠麻醉后活體取材，取出導(dǎo)管后輕輕剝?nèi)?dǎo)管，暴露導(dǎo)管內(nèi)部新生的坐骨神經(jīng)，取出遠(yuǎn)端側(cè)神經(jīng)并放入預(yù)冷的戊二醛中固定。后經(jīng)1%鋨酸固定、醋酸鈾塊染、梯度乙醇脫水、半薄切片定位、超薄切片、枸櫞酸鉛復(fù)染等步驟，采用透射電鏡拍照觀察遠(yuǎn)側(cè)端再生髓鞘情況。

1.8 靶肌濕重比計(jì)算 模型制備完成后，按照相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取大鼠后肢術(shù)側(cè)和健康側(cè)的腓腸肌和脛前肌，并用分析天平稱重并記錄，采用術(shù)側(cè)與健康側(cè)的比值計(jì)算相應(yīng)組別的靶肌濕重比。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析，Photoshop CS6 軟件進(jìn)行圖片處理，數(shù)據(jù)以表示。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分子質(zhì)量復(fù)合型絲素導(dǎo)管的安全性評價(jià)及功能性評價(jià)

2.1.1 體內(nèi)降解 導(dǎo)管的體內(nèi)降解主要是將導(dǎo)管植入兔子皮下并將導(dǎo)管逐個(gè)稱重，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)將導(dǎo)管取出再稱重最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在30 d 時(shí)，兩種導(dǎo)管的降解率均接近40%，降解速度較快；到90 d 時(shí)，降解速率明顯放緩；最后到180 d 時(shí)，兩種導(dǎo)管降解率均＞50%，其中SF180 的導(dǎo)管降解率近70%（圖1)。

圖1 不同分子質(zhì)量的復(fù)合絲素蛋白導(dǎo)管在體內(nèi)的降解率

2.1.2 蘇木精-伊紅染色 通過蘇木精-伊紅染色的手段觀察這兩種導(dǎo)管在體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。由圖2（見封三)可見，植入1 周后中性粒細(xì)胞引起輕微炎癥反應(yīng)；4 周時(shí)，導(dǎo)管周圍開始出現(xiàn)多核細(xì)胞，可能是慢性炎癥產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞融合引起。表明植入導(dǎo)管1個(gè)月后體內(nèi)的炎癥反應(yīng)明顯減輕；在8 周和12 周時(shí)，導(dǎo)管四周幾乎看不見單核細(xì)胞和多核細(xì)胞，表明兩種導(dǎo)管在植入后期無明顯炎癥反應(yīng)。

圖2 植入大鼠體內(nèi)兩種導(dǎo)管的蘇木精-伊紅染色（Bar=100 μm)

2.2 復(fù)合型絲素導(dǎo)管的功能性評價(jià)

2.2.1 再生軸突和髓鞘染色 用NF 和S100 兩種抗體來標(biāo)記再生坐骨神經(jīng)的軸突和髓鞘，通過免疫組織化學(xué)染色觀察導(dǎo)管內(nèi)部坐骨神經(jīng)再生的情況。由圖3（見封三)可見，1 周時(shí)缺損組坐骨神經(jīng)的近端和遠(yuǎn)端沒有連接生長，且遠(yuǎn)端的軸突與髓鞘還未退化；而在導(dǎo)管組中，兩種導(dǎo)管內(nèi)部呈現(xiàn)中空的結(jié)構(gòu)，并未出現(xiàn)坐骨神經(jīng)再生，自體組再生效果最好。在4周時(shí)，缺損組的遠(yuǎn)端神經(jīng)出現(xiàn)軸突和髓鞘退化現(xiàn)象；而在導(dǎo)管組中，導(dǎo)管的近端神經(jīng)逐漸向前生長，表現(xiàn)出明顯的再生軸突和髓鞘，遠(yuǎn)端也未出現(xiàn)明顯的軸突和髓鞘退化現(xiàn)象。在8 周和12 周時(shí)，缺損組的近端和遠(yuǎn)端逐漸連接在一起，12 周時(shí)缺損組的坐骨神經(jīng)邊緣出現(xiàn)少量軸突和髓鞘組織，但在內(nèi)部為中空狀；在導(dǎo)管組中，坐骨神經(jīng)開始出現(xiàn)明顯的再生過程。在12 周時(shí)兩個(gè)導(dǎo)管組內(nèi)部出現(xiàn)明顯的軸突和髓鞘組織，并直接貫穿于整個(gè)導(dǎo)管組織，表明導(dǎo)管內(nèi)的大鼠坐骨神經(jīng)再生成功。

圖3 導(dǎo)管內(nèi)坐骨神經(jīng)的再生軸突和髓鞘的免疫熒光染色

2.2.2 神經(jīng)遠(yuǎn)端透射電鏡觀察 通過透射電鏡來觀察3 個(gè)月導(dǎo)管內(nèi)遠(yuǎn)端再生神經(jīng)的髓鞘，將神經(jīng)取材用戊二醛固定及超薄切片染色后進(jìn)行觀察。由圖4可見，缺損組膠原纖維和髓鞘共存，而自體和導(dǎo)管則沒有膠原纖維存在，表明導(dǎo)管組和自體組再生神經(jīng)效果均好于缺損組。此外，從髓鞘厚度來看，缺損的髓鞘厚度相對較薄，自體組的髓鞘厚度最厚，導(dǎo)管組的髓鞘厚度比自體組略薄，但明顯厚于缺損組。髓鞘是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展過程中必不可缺少的結(jié)構(gòu)，其主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)相互排成層狀，因此髓鞘的層狀越厚表明髓鞘形成越好。因此，該透射結(jié)果也表明兩種導(dǎo)管所再生的髓鞘效果良好。

圖4 術(shù)后3 個(gè)月坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)端透射電鏡圖（Bar=5 μm，250 nm)

2.2.3 靶肌濕重比 在神經(jīng)缺損發(fā)生后會患者造成感覺和功能喪失之外，還會導(dǎo)致周圍肌肉萎縮。在大鼠坐骨神經(jīng)缺損并用制備的導(dǎo)管橋接手術(shù)后12 周，對大鼠的后肢健康側(cè)和術(shù)側(cè)的腓腸肌和脛前肌進(jìn)行灌注取材，并計(jì)算其濕重比。由圖5 可見，缺損組脛前肌和腓腸肌濕重比明顯小于自體組和導(dǎo)管組，表明導(dǎo)管組和自體組的肌肉萎縮恢復(fù)效果明顯優(yōu)于缺損組，而導(dǎo)管組和自體組的靶肌濕重比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)出導(dǎo)管的促神經(jīng)再生應(yīng)用價(jià)值。

圖5 術(shù)后12 周腓腸肌和脛前肌肌肉濕重比統(tǒng)計(jì)（*P＜0.05)

3 討論

眾所周知，在外周神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域，除了自體移植這一金標(biāo)準(zhǔn)的修復(fù)辦法外，神經(jīng)導(dǎo)管移植物也逐漸成為臨床有效的修復(fù)辦法之一[11]。目前，由殼聚糖制備的神經(jīng)移植物已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中取得較好的修復(fù)效果，有學(xué)者[12]也致力于研究效果更好的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物的降解和生物相容性成為至關(guān)重要的因素。本研究選取桑蠶絲素蛋白為主要材料制備了復(fù)合型絲素蛋白導(dǎo)管并對其在外周神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了研究。絲素蛋白經(jīng)氯化鈣/乙醇/水三元溶液分別溶解30 min 和180 min，分別得到100 ku（SF30)和50 ku（SF180)分子質(zhì)量的可溶性絲素蛋白，這兩種絲素蛋白紅外光譜無明顯差異[1]?？扇苄越z素蛋白經(jīng)乙醇變性得到不溶絲素蛋白支架材料，研究[2-3]表明，SF30 的絲素蛋白比SF180支架具有較好的力學(xué)性能和較慢的降解速度?？紤]到絲素蛋白本身降解慢的問題，本研究制備了SF30和SF180 絲素蛋白用于改善絲素蛋白的降解速度。由于小分子質(zhì)量的絲素蛋白機(jī)械性能較差，不足以支持體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過改善成功制備了機(jī)械性能較好的復(fù)合型導(dǎo)管，并將該復(fù)合型導(dǎo)管用于大鼠坐骨神經(jīng)缺損1 cm 和橋接模型，橋接手術(shù)完成后在1、4、8、12 周對大鼠進(jìn)行灌注取材并進(jìn)行一系列的指標(biāo)分析。此外，還單獨(dú)對導(dǎo)管在兔子體內(nèi)的降解反應(yīng)以半年為周期進(jìn)行觀察，并對其降解率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)用于評估該復(fù)合型導(dǎo)管的降解效果。在最開始1 個(gè)月時(shí)，導(dǎo)管在兔子體內(nèi)降解速率較快，可能是由導(dǎo)管的結(jié)構(gòu)造成的[13]。該復(fù)合型導(dǎo)管主要分為3 層，最外層是小分子質(zhì)量的絲素蛋白涂層，該部分是降解速率較快的主要原因；導(dǎo)管中層是編織的絲素線，該絲素未經(jīng)任何處理所以較難降解，可以解釋導(dǎo)管在體內(nèi)30～90 d 降解率較為平緩的現(xiàn)象；導(dǎo)管的內(nèi)部是小分子質(zhì)量絲素的靜電紡絲層，該部分降解較快。最終在180 d 時(shí)，兩種小分子質(zhì)量的導(dǎo)管降解率均＞50%，SF180 絲素蛋白支架降解速度快于SF30 絲素支架，原因在于SF180的導(dǎo)管降解速率顯著高于SF30。從蘇木精-伊紅分析結(jié)果看，第1 周時(shí)表現(xiàn)為急性炎癥反應(yīng)，從第4 周開始炎癥反應(yīng)逐漸減輕直到消失，這兩種分子質(zhì)量的絲素蛋白支架炎癥反應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該復(fù)合型導(dǎo)管在大鼠體內(nèi)具有良好的生物安全性。

神經(jīng)再生是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，軸突和髓鞘的形成不可或缺[14]。因此采用NF 和S100 抗體分別標(biāo)記軸突和髓鞘[15]，染色觀察在1、4、8、12 周時(shí)導(dǎo)管內(nèi)坐骨神經(jīng)再生的過程。從染色結(jié)果中可以看出，4周時(shí)導(dǎo)管組神經(jīng)出現(xiàn)明顯的再生現(xiàn)象，8 周和12 周時(shí)導(dǎo)管內(nèi)的坐骨神經(jīng)有明顯的軸突和髓鞘生成，表明這兩種絲素蛋白導(dǎo)管雖然具有促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生的功能，但兩種分子質(zhì)量的絲素蛋白之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了進(jìn)一步觀察再生的髓鞘，本實(shí)驗(yàn)針對術(shù)后3 個(gè)月的再生坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)端進(jìn)行透射電鏡觀察，缺損組雖然有髓鞘生長，但仍存在大量膠原纖維；而導(dǎo)管組再生坐骨神經(jīng)的髓鞘層厚度與自體移植組的層厚度相接近，表明導(dǎo)管組的坐骨神經(jīng)髓鞘組織再生相對完好。坐骨神經(jīng)缺損后除了會導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失，還會導(dǎo)致周圍脛前肌和腓腸肌肌肉萎縮，神經(jīng)再生后，肌肉萎縮程度明顯改善[16]。從靶肌濕重比的結(jié)果來看，術(shù)后3 個(gè)月缺損組的肌肉萎縮近健康肌肉的一半，而導(dǎo)管組和自體組肌肉萎縮程度明顯改善，與缺損組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但SF30 與SF180間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究成功制備了復(fù)合型絲素蛋白導(dǎo)管，改善了絲素蛋白導(dǎo)管的降解問題以及機(jī)械性能。在大鼠坐骨神經(jīng)橋接模型中，在12 周時(shí)SF30 與SF180 復(fù)合絲素導(dǎo)管均能明顯促進(jìn)大鼠1 cm 坐骨神經(jīng)缺損再生，兩種導(dǎo)管間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；本研究制備的復(fù)合絲素導(dǎo)管在180 d 內(nèi)降解率均＞50%，且SF180復(fù)合絲素導(dǎo)管降解速度顯著快于SF30，有望實(shí)現(xiàn)支架降解與損傷恢復(fù)同步。本研究結(jié)果既為絲素蛋白導(dǎo)管對外周神經(jīng)的臨床試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為絲素蛋白支架的降解提供了新思路。