劉 玫,馬 豪,鄭學玲,李利民,劉 翀
河南工業(yè)大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001
抗凍蛋白(antifreeze proteins, AFPs)是一些生活在零度以下環(huán)境中的生物產(chǎn)生的抵抗冷凍威脅的蛋白,其能夠與冰晶結(jié)合從而修飾冰晶形態(tài)、降低溶液冰點、抑制冰晶重結(jié)晶,因此也被稱為冰結(jié)合蛋白。自20世紀60年代末在南極魚類的血液中發(fā)現(xiàn)了抗凍糖蛋白以來,在許多生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了各種類型的AFPs[1],其中植物AFPs與其他AFPs相比有著更好的抑制冰晶重結(jié)晶活性[2],這可能是由于植物AFPs通常含有多個親水性冰晶結(jié)合域,似乎在吸附冰晶方面特別有效,從而在接近冰點的溫度或凍融條件下阻止水分子的遷移,控制冰晶生長[3-5]。基于這個特性,植物AFPs在冷凍食品中有著很好的應(yīng)用前景。
冷凍面團技術(shù)作為速凍發(fā)酵面制品的關(guān)鍵技術(shù),具有工業(yè)化生產(chǎn)和質(zhì)量標準化等優(yōu)越性,有利于烘焙行業(yè)連鎖經(jīng)營模式的快速發(fā)展,能夠減少產(chǎn)品老化帶來的經(jīng)濟損失,提高產(chǎn)品的新鮮度和安全性[6-7]。因此,冷凍面團技術(shù)具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。然而,冷凍面團在長期的運輸儲藏以及凍融過程中會經(jīng)歷一系列的溫度波動,這會引起面團內(nèi)部的冰晶生長和重結(jié)晶。有研究凍藏過程中冰晶重結(jié)晶會導致冷凍面團中主要組分產(chǎn)生劣變,并最終導致面團及其制品品質(zhì)劣變[8-9],如酵母細胞受到損傷、酵母活性降低,致使面團后期產(chǎn)氣能力不足[10-11];面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞,致使面團持氣能力下降[12-13];淀粉的顆粒形態(tài)遭到破壞,理化性質(zhì)產(chǎn)生變化[14-15],致使面團烘焙性能下降[16-17]等。
因此,在冷凍面團品質(zhì)改良的研究中,抑制其內(nèi)部冰晶重結(jié)晶是非常重要的。而植物AFPs有著很好的抑制冰晶重結(jié)晶效果,因此,對冷凍面團的改良效果顯著。作者綜述了近年來植物AFPs的特性研究及其在冷凍面團中的應(yīng)用研究進展,以期為植物AFPs在速凍面制品中的應(yīng)用提供指導。
自1992年首次發(fā)表關(guān)于植物AFPs的報告以來[18],已在60多種植物中檢測到具有抗凍活性的蛋白,并提純分析了20余種(表1)。植物AFPs主要存在于越冬植物的葉片、種子、莖、根、樹皮等不同部位。不同植物AFPs的結(jié)構(gòu)不相同,其抗凍活性也各有差異。
表1 不同植物的抗凍蛋白Table 1 Antifreeze proteins from different plants
植物AFPs的抗凍活性體現(xiàn)在3個方面,即:修飾冰晶形態(tài)、冰點熱滯效應(yīng)、抑制冰晶重結(jié)晶性,其中抑制冰晶重結(jié)晶性最為突出[36]。
1.2.1 修飾冰晶形態(tài)
冰晶有很多晶體平面,主要分為基面和棱面[37-38]。而植物AFPs主要與冰晶的棱面結(jié)合,減緩此平面附近的生長,且為AFPs結(jié)合提供更多的靶平面,從而控制冰晶生長,修飾冰晶形成溫和的六邊形柱晶體[1]。
1.2.2 熱滯活性
與冰晶結(jié)合也是AFPs具有熱滯活性和抑制冰晶重結(jié)晶活性的原因。AFPs與冰晶結(jié)合從而使其冰點降低到平衡熔點以下,導致凍結(jié)滯后,產(chǎn)生熱滯效應(yīng)[39]。植物AFPs熱滯值通常較低,可能是由于植物屬于耐凍物種,耐凍物種的AFPs主要作用可能是抑制冰晶重結(jié)晶,使細胞內(nèi)外的冰晶保持較小,而不太可能是降低冰點[40]。因為冰點過低,過冷環(huán)境下會促進細胞內(nèi)冰的形成以及快速、潛在的爆發(fā)式冰晶生長,導致細胞組織嚴重損傷,而在接近平衡冰點的溫度下凍結(jié)可以產(chǎn)生更高的存活率[41-42]。因此,植物傾向于低熱滯值,這可能允許更可控的冰晶生長[36]。這對于冷凍面團體系似乎也適用,控制面團內(nèi)部冰晶生長,使冰晶保持細小均勻,能夠減少面團所受損害。
1.2.3 抑制冰晶重結(jié)晶活性
抑制冰晶重結(jié)晶活性是植物AFPs最顯著的優(yōu)勢。當植物的體液達到冰點時,由于非均質(zhì)成核劑的存在,許多小冰晶在細胞外形成。隨著時間的推移,由于Ostwald熟化效應(yīng),大冰晶以小冰晶的減少為代價逐漸生長增大,稱為冰重結(jié)晶[1]。大冰晶的生長是有害的,即使它發(fā)生在細胞外,由于膜的機械損傷或脫水也會對細胞造成損傷[43-44]。而植物AFPs通常含有多個親水性冰晶結(jié)合域,能夠更有效地與冰晶結(jié)合,抑制冰晶生長且降低冰點,使冰晶不能聚集增大,從而產(chǎn)生顯著的抑制冰晶重結(jié)晶效果。且一般只需要極低質(zhì)量濃度的植物AFPs,大約1 μg/mL,即可抑制冰晶重結(jié)晶,使冰晶保持細小均勻[45-46]。抑制冰晶重結(jié)晶活性的量化通常基于抑制冰晶重結(jié)晶終點的計算。抑制冰晶重結(jié)晶終點是指仍然能阻止冰重結(jié)晶的AFPs的最低濃度。然而,抑制冰晶重結(jié)晶也可能是由AFPs以外的溶質(zhì)引起的,因此,抑制冰晶重結(jié)晶分析通常在高濃度溶質(zhì)(23%~30%蔗糖)下進行,以減少非特異性效應(yīng)。根據(jù)以往研究,植物AFPs已經(jīng)表現(xiàn)出最大的抑制冰晶重結(jié)晶活性,其中以黑麥草冰活性蛋白(IAP)的抑制冰晶重結(jié)晶終點最低(IAP3和IAP5為3 μg/mL,IAP2為0.6 μg/mL),其次為胡蘿卜AFP(1 μg/mL)、連翹 AFP(6 μg/mL)、沙棘 AFP(12 μg/mL)和D.antarctica(15.6 μg/mL)[46]。
植物AFPs主要是幫助植物耐受低溫,而不是抵抗低溫,因此對于植物中的這些AFPs更準確的說法應(yīng)該是冰結(jié)合蛋白,其通過與冰晶結(jié)合,直接參與冰晶的形成過程,從而直接保護植物免受低溫的影響[1]。不同來源的AFPs作用方式不同,目前提出的AFPs抗凍機制的假說有很多,如吸附抑制假說[47]、晶格匹配假說[48]、偶極子-偶極子假說[49]、剛體能量假說[50]、表面互補假說[51]等。其中吸附抑制假說很好地解釋了AFPs溶液冰點滯后的原因,但吸附抑制假說所暗示的AFPs與冰晶不可逆結(jié)合的概念表明,不同類型的AFPs的活性沒有差異,也沒有濃度依賴性[1]。然而,許多實驗表明,熱滯活性(TH活性)是有濃度依賴性的,通常與蛋白質(zhì)濃度的平方根成比例,且相同濃度的不同類型AFP的TH活性不同[52-53]。因此,進一步的研究認為對于只結(jié)合棱面不結(jié)合基面的AFP,TH與其結(jié)合率和溶液蛋白濃度密切相關(guān),因為當AFP與冰晶棱面結(jié)合并阻止其棱面生長后,晶體繼續(xù)在基面方向生長,直到形成雙錐形狀且尖端沒有暴露的基面,此時,冰晶停止生長,且任何進一步的潛在生長都被溶液中的AFP阻止,這個理論既符合不可逆結(jié)合,也符合TH活性的蛋白質(zhì)濃度依賴性,但不適用于結(jié)合基面的AFP;對于結(jié)合基面的AFP,其TH活性并不直接依賴于溶液中AFP濃度,而與其表面濃度更相關(guān)[54-55]。
AFPs與冰晶結(jié)合是其具有抗凍活性的根本原因,不少研究者提出了AFPs與冰晶結(jié)合的模型為錨定籠形水模型[1,56],即AFPs冰結(jié)合面的冰結(jié)合位點可能將水組織成一種約束的冰狀模型,類似于冰面附近的準液態(tài)水層,這兩層類似冰的液態(tài)層隨后會合并并變成冰,從而在低于熔點的溫度下將AFPs凍結(jié)在冰面上,導致不可逆吸附[57-58]。這阻止了水分子從準液態(tài)層進入冰晶晶格,從而抑制冰晶生長。這也可能“釘住”了冰晶表面,抑制了融化,從而抑制了冰晶重結(jié)晶[36]。但此機制對于植物AFPs是否適用還有待研究。并且不同來源的植物AFPs其結(jié)構(gòu)具有顯著的多樣性,抗凍活性也不盡相同,而其結(jié)構(gòu)與抗凍活性之間的關(guān)系還不甚清楚,因此未來研究需要探明植物AFPs抗凍活性與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系,從而更好地利用植物AFPs。
在冷凍食品行業(yè),由于冷凍、解凍和溫度波動而造成的冰的生長和重結(jié)晶是導致產(chǎn)品質(zhì)量下降的主要原因。因此,解決冰晶的生長和重結(jié)晶問題對于本行業(yè)的發(fā)展是至關(guān)重要的。冷凍面團是冷凍發(fā)酵面制品生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù),冰晶生長和重結(jié)晶會導致冷凍面團主要組分劣變并最終影響面團及其制品品質(zhì)[9]。而植物AFPs具有很好的抑制冰晶重結(jié)晶效果,因此利用植物AFPs改良冷凍面團品質(zhì),具有其他改良劑所不具備的獨特優(yōu)勢。目前,植物AFPs對冷凍面團品質(zhì)改良方面的研究也較多。
面筋蛋白通過賦予面團黏彈性、持水性以及形成面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等對冷凍面團及最終產(chǎn)品的品質(zhì)非常重要。然而,冷凍面團在凍藏過程中,面筋蛋白會發(fā)生解聚行為,使面團的黏彈性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞,影響冷凍面團及最終產(chǎn)品的品質(zhì)[59]。添加冬小麥AFP[60]、燕麥AFP[61]能夠保護面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),改善面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)中不規(guī)則空洞的形成,提高面筋蛋白的凍藏穩(wěn)定性。添加女貞葉AFP能夠有效抑制面團在-18 ℃凍藏期間面筋蛋白的脫水、α-螺旋減少、β-折疊和HMW/LMW增加,改善面團的流變性能[62]。燕麥AFP可以降低凍藏過程中冷凍面筋蛋白彈性模量和黏性模量的下降趨勢,保護面筋蛋白的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)免受冰晶損傷,保護面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[31,61],且能夠減緩凍融處理對小麥面筋蛋白持水性、持油性和乳化穩(wěn)定性的影響[63]。另外由于天然植物AFP存在提取純化困難、成本高和產(chǎn)量低等不足,劉玫[9]利用畢赤酵母GS115重組生產(chǎn)胡蘿卜AFP(rCaAFP),并研究了其對水合面筋在凍融循環(huán)過程中的理化性質(zhì)的影響,研究發(fā)現(xiàn)rCaAFP減輕了GMP解聚作用,減輕了凍融循環(huán)對水合面筋二硫鍵、二級結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)的破壞,保護了水合面筋在凍融循環(huán)過程中的流變特性,此研究從面筋蛋白的結(jié)構(gòu)和功能方面對小麥面筋在冷凍貯藏過程中的劣化過程有更多的了解,為更好地利用rCaAFP保存冷凍面團提供理論依據(jù)。綜上所述,植物AFPs對冷凍面筋蛋白的結(jié)構(gòu)以及流變學特性的影響的研究較多,而關(guān)于植物抗凍蛋白對面筋蛋白亞基、分子組成和功能特性的影響以及兩種蛋白之間是否存在相互作用的研究還鮮有報道,因此,接下來的研究應(yīng)從這幾個方面更加全面深入地探明植物抗凍蛋白對冷凍面團中面筋蛋白的影響。
冷凍面團在凍藏過程中,酵母的損傷和死亡最終會導致面團后期發(fā)酵能力不足,醒發(fā)時間長,且酵母損傷釋放的谷胱甘肽會損傷面筋網(wǎng)絡(luò),導致面團持氣能力不足,最終導致面團及制品品質(zhì)劣變,體積小。有研究表明面團經(jīng)凍融后,酵母細胞菌落數(shù)顯著下降,酵母細胞谷胱甘肽釋放量呈上升趨勢,而添加黑麥草AFP[64]、女貞葉AFP[65]和胡蘿卜AFP[66]都能夠有效提高酵母的存活率,同時顯著減少酵母細胞谷胱甘肽的釋放量,減少面團中面筋蛋白的分解,從而有效改善冷凍面團產(chǎn)氣持氣能力。大麥籽粒AFP-1[32,67]和燕麥AFP[68]能夠通過降低冷凍及凍融循環(huán)對面團彈性模量及黏性模量的破壞,保護面團面筋網(wǎng)絡(luò),同時降低冷凍及凍融循環(huán)對酵母產(chǎn)氣能力的破壞從而提高面團烘焙特性,保持面包品質(zhì)。
冷凍面團中水分含量、物理狀態(tài)及分布也對其品質(zhì)至關(guān)重要,因為這與面團的醒發(fā)以及形成一個具有良好持氣性及面包孔隙結(jié)構(gòu)的終產(chǎn)品有很大的關(guān)系[64,69]。面團經(jīng)凍融和凍藏處理后,其可凍結(jié)水含量增多,并且水分流動性增大,面團中可凍結(jié)水含量會顯著影響面團的品質(zhì),可凍結(jié)水含量與凍藏期間面團中冰晶數(shù)量直接相關(guān)[70],而冰晶是凍藏過程中淀粉面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞的主要因素,因而凍藏過程中面團體系中可凍結(jié)水含量的多少對面團結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)添加大麥籽粒AFP[32]、燕麥AFP[31]、黑麥草AFP[64]和重組胡蘿卜AFP[9]都能有效減緩冷凍面團含水率的下降,減弱凍融處理對水分遷移率的影響,降低面團的可凍結(jié)水含量,影響面團的水分分布,從而有效緩解面團凍藏過程中品質(zhì)劣變,改善面團品質(zhì)。
冷凍面團在凍藏過程中主要組分的劣變會導致最終產(chǎn)品出現(xiàn)醒發(fā)時間延長、體積減小、口感變差、消費性下降等問題,這限制了冷凍面團的大規(guī)模應(yīng)用。隨著凍藏時間的延長,面團醒發(fā)時間逐漸增加,在凍藏5周后,空白面團醒發(fā)時間由70 min增加至107 min,而添加女貞葉熱穩(wěn)定冰結(jié)構(gòu)蛋白的面團醒發(fā)時間由70 min增加至99 min,表明添加植物AFPs能夠降低凍藏處理對面團醒發(fā)時間的延長,這可能是由于植物AFPs較好地抑制冰晶重結(jié)晶特性,減少了冰晶對酵母和面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞,從而提高了面團發(fā)酵能力和持氣能力[71]。丁香麗等[32]研究發(fā)現(xiàn)大麥籽粒AFP也能顯著縮短冷凍面團醒發(fā)時間,劉玫等[9]研究了重組胡蘿卜AFP對冷凍面團醒發(fā)時間的影響也得到相似結(jié)果。由冷凍面團制得的面包和饅頭的品質(zhì)劣變主要體現(xiàn)在比容的降低和質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的惡化。添加0.5%女貞葉熱穩(wěn)定冰結(jié)構(gòu)蛋白能夠顯著增加冷凍面團面包的比容,在凍藏1、3、5周后,與空白面團面包相比,比容增加幅度分別達到3.22%、4.69%和5.02%[71]。大麥籽粒AFP也能夠顯著增加冷凍面團面包比容[32],表明添加植物AFPs能夠降低凍藏對冷凍面團制品比容的不利影響。面包和饅頭的質(zhì)構(gòu)特性與其口感密切相關(guān),冷凍面團饅頭的硬度隨著凍藏時間的延長呈增加趨勢,而在相同凍藏條件下,添加燕麥AFP的冷凍面團饅頭硬度較之顯著降低[31]。賈春利[71]研究發(fā)現(xiàn),在凍藏5周后添加0.5%女貞葉冰結(jié)構(gòu)蛋白的冷凍面團面包瓤比空白面團面包瓤軟化了12.1%,這可能是由于添加植物AFPs降低了冰晶對面團內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞,使制品更松軟,硬度較小。凍藏處理會導致制品彈性、內(nèi)聚力和回復性降低,而在添加重組胡蘿卜AFP后,其降低程度顯著減小[9]。
綜上可知,植物AFPs較好地抑制冰晶重結(jié)晶特性,能夠降低冰晶對冷凍面團各組分的不利影響,改善冷凍面團及其制品品質(zhì)。
冷凍面團在凍藏過程中由于溫度波動引起內(nèi)部冰晶重結(jié)晶,會導致面團品質(zhì)劣變,并最終影響制品品質(zhì),這限制了冷凍面團技術(shù)的發(fā)展。因此,抑制冷凍面團冰晶重結(jié)晶是其發(fā)展道路上亟須解決的問題,而植物AFPs具有較好的抑制冰晶重結(jié)晶特性,能夠很好解決這個問題,且AFPs無毒性,在多種食品中添加不會產(chǎn)生負面影響,其功能特性與任何毒性蛋白沒有關(guān)聯(lián)[72]。因此,植物AFPs將是克服冷凍面團技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵因素。但是現(xiàn)如今對于植物AFPs作用機制、結(jié)構(gòu)解析及開發(fā)應(yīng)用的研究還較少,這就需要做進一步的研究,以便更好地利用植物AFPs改良冷凍食品品質(zhì)。