肖惠惠，曾芳芳，王殿軒*，黃依林，白春?jiǎn)?，趙 超，唐培安

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，糧食儲(chǔ)藏與安全教育部工程研究中心，糧食儲(chǔ)運(yùn)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001 2.江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023

害蟲(chóng)對(duì)物質(zhì)氣味的反應(yīng)及行為既關(guān)系到儲(chǔ)糧昆蟲(chóng)化學(xué)生態(tài)行為表現(xiàn)，也關(guān)系到儲(chǔ)藏物料對(duì)害蟲(chóng)易感染物質(zhì)和害蟲(chóng)綜合治理中一些特性物質(zhì)的利用。碎小麥中二氯甲烷提取物對(duì)玉米象、鋸谷盜、赤擬谷盜、銹赤扁谷盜有引誘作用[1]，燕麥揮發(fā)物對(duì)鋸谷盜和大眼鋸谷盜有很強(qiáng)的引誘作用[2]，80 ℃時(shí)玉米、小麥和稻谷的揮發(fā)物2-乙基己醇、(+)-δ-蓽澄茄烯、胡椒酮和檸檬烯對(duì)米象和玉米象有不同程度的定向引誘作用[3]，但天堂椒揮發(fā)物對(duì)米象有驅(qū)避作用[4]。65 ℃時(shí)全麥粉、黃豆粉、玉米粉、蕎麥粉、小米粉和高粱粉的萃取揮發(fā)物可顯著引誘長(zhǎng)頭谷盜雌、雄成蟲(chóng)[5]。三七、當(dāng)歸、天麻和前胡等中藥材的揮發(fā)物對(duì)藥材甲引誘作用明顯[6]。高溫下儲(chǔ)藏物糧食的揮發(fā)物對(duì)害蟲(chóng)具有引誘作用，同種谷物對(duì)不同害蟲(chóng)的引誘作用也存在差異。常溫下谷物中揮發(fā)物種類(lèi)與數(shù)量顯著減少，對(duì)害蟲(chóng)的引誘影響程度也不相同[7]。銹赤扁谷盜(Cryptolestesferrugineus(Stephens))是一種世界性發(fā)生的常見(jiàn)儲(chǔ)糧害蟲(chóng)，其成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)均可危害破碎谷物、豆類(lèi)、油料等，當(dāng)種群密度較大時(shí)易引起儲(chǔ)糧發(fā)熱霉變，甚至嚴(yán)重影響糧食安全儲(chǔ)藏，造成經(jīng)濟(jì)和糧食質(zhì)量損失[8-13]。當(dāng)前通常采用化學(xué)方法防治此類(lèi)害蟲(chóng)，銹赤扁谷盜對(duì)常用熏蒸劑磷化氫的抗藥性普遍且嚴(yán)重[14-16]，采集于山西省呂梁地區(qū)的銹赤扁谷盜品系抗性系數(shù)為敏感品系的668倍[14]，采集于湖北省麻城地區(qū)銹赤扁谷盜品系的抗性比敏感品系高838倍[17]。銹赤扁谷盜的熏蒸難度遠(yuǎn)高于其他害蟲(chóng)[18]，由此導(dǎo)致熏蒸失敗的案例常有發(fā)生[19]。

昆蟲(chóng)可通過(guò)其嗅覺(jué)感知食物從而做出行為反應(yīng)[2]，利用昆蟲(chóng)選擇取食或產(chǎn)卵場(chǎng)所等習(xí)性，研究?jī)?chǔ)藏物糧食中的揮發(fā)性引誘物有望用于誘捕、防治害蟲(chóng)來(lái)降低和控制害蟲(chóng)種群密度，減少化學(xué)藥劑使用。有些儲(chǔ)藏物甲蟲(chóng)對(duì)食物揮發(fā)物的趨向性反應(yīng)已有報(bào)道，但關(guān)于銹赤扁谷盜對(duì)食物揮發(fā)物的電生理反應(yīng)的研究缺乏。作者研究了常溫下不同破碎程度小麥的揮發(fā)性物質(zhì)成分與相對(duì)含量，并研究了銹赤扁谷盜對(duì)相對(duì)含量較高物質(zhì)的觸角電位反應(yīng)，以期為分析和明確該害蟲(chóng)的有效引誘物質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

試驗(yàn)所用銹赤扁谷盜采自河南新鄉(xiāng)某糧庫(kù)中，在河南工業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)培養(yǎng)室中培養(yǎng)數(shù)代，培養(yǎng)條件為(28±1) ℃，RH75%±5%，全黑暗，喂食全麥粉∶燕麥∶酵母∶碎麥質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的飼料。以羽化2周銹赤扁谷盜成蟲(chóng)為試蟲(chóng)。

1.2 樣品

采用的小麥為當(dāng)年收獲的新麥品種208，水分含量12.5%，以完整小麥、破碎小麥和全麥粉為試驗(yàn)材料，碎小麥為粉碎后過(guò)直徑為2.0 cm和1.5 cm 篩的中間分離物，全麥粉采用錘式旋風(fēng)磨將其粉碎成粉末狀態(tài)。備好的材料裝入干凈自封袋中放入-20 ℃冰箱1個(gè)月以消除其中可能的昆蟲(chóng)感染，試驗(yàn)前平衡至室溫。

1.3 主要試劑

石蠟油(標(biāo)準(zhǔn)品)、反式-2-癸烯醛(純度>93%)：北京百威靈科技有限公司；檸檬烯(純度≥97%)、正己醇(純度≥99%)、1-辛烯-3醇(純度≥98%)、壬醛(純度≥98%)、戊醛(純度≥97%)、辛醛(純度≥99%)、庚醛(純度≥99%)：Sigma-Aldrich。

1.4 儀器與設(shè)備

BLH-5601錘式旋風(fēng)磨：浙江伯利恒儀器設(shè)備有限公司；QP2010氣相色譜儀：日本島津有限公司；DG8W顯微鏡：舜宇儀器有限公司；DGX-8243B電熱鼓風(fēng)干燥箱：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；57348-U固相微萃取頭：美國(guó)Sigma-Aldrich集團(tuán)有限公司；Y型嗅覺(jué)儀：鄭州晶林科技有限公司；FW135植物微型粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；ACO-318氣體循環(huán)氣泵：廣東海利集團(tuán)有限公司；FCD-217SE冰箱：海爾電冰柜有限公司；SHP-350生化培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.5 揮發(fā)物成分測(cè)定

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)技術(shù)結(jié)合氣相-質(zhì)譜法(GC-MS)對(duì)樣品的揮發(fā)物成分進(jìn)行測(cè)定。 稱(chēng)取10.00 g樣品于60 mL的頂空萃取瓶中，加緊瓶蓋后于(28±1) ℃下平衡24 h，再將萃取頭插入頂空瓶中萃取30 min，于GC-MS進(jìn)樣口250 ℃下解析2 min。分析中色譜柱為DB-5MS石英毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm，Agilent)。進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流，色譜柱起始溫度50 ℃，以4 ℃/min升溫至125 ℃，保持3 min，又以4 ℃/min升溫至165 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。載氣采用高純度氦氣，柱壓為87 kPa。不分流進(jìn)樣2 min，柱流量1.5 mL/min。接口溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃；電離方式為EI，電離能量70 eV，掃描范圍m/z35～350 amu；采用全掃描采集模式。

1.6 選擇反應(yīng)測(cè)定

采用臂長(zhǎng)8 cm，內(nèi)徑1 cm，兩臂夾角75°，柄長(zhǎng)8 cm的Y型嗅覺(jué)儀。每個(gè)管臂各接一個(gè)特制200 mL的味源瓶，將20 g食料放入味源瓶作為處理，經(jīng)活性炭過(guò)濾的凈化空氣作為對(duì)照，通過(guò)流量計(jì)控制氣流速率為200 mL/min，管柄接真空泵。試驗(yàn)環(huán)境為 (28±1) ℃、RH60%～70%和全暗光。

逐頭引進(jìn)饑餓24 h的銹赤扁谷盜雌或雄成蟲(chóng)于Y型嗅覺(jué)儀管柄處，觀測(cè)試蟲(chóng)爬至超過(guò)Y型支臂長(zhǎng)度的2/3且1 min內(nèi)不返回者記為有選擇反應(yīng)，5 min內(nèi)無(wú)選擇者視為不反應(yīng)。雌、雄成蟲(chóng)各以20頭為1組，共進(jìn)行3組平行。其中，每測(cè)5頭試蟲(chóng)調(diào)換一次Y型管方向，每測(cè)10頭用無(wú)水乙醇擦洗管路內(nèi)外壁，完全干燥后再用。試蟲(chóng)對(duì)不同物質(zhì)的選擇反應(yīng)參數(shù)按下式計(jì)算。

選擇系數(shù)=(處理臂管中蟲(chóng)數(shù)-對(duì)照臂管中蟲(chóng)數(shù))/反應(yīng)總蟲(chóng)數(shù)；

引誘率=處理臂管中蟲(chóng)數(shù)/總測(cè)試蟲(chóng)數(shù)×100%；

反應(yīng)率=(處理臂管中蟲(chóng)數(shù)+對(duì)照臂管中蟲(chóng)數(shù))/總測(cè)試蟲(chóng)數(shù)×100%。

%

1.7 銹赤扁谷盜對(duì)不同破碎度小麥及其中揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)測(cè)定

用解剖刀將銹赤扁谷盜雌或雄成蟲(chóng)觸角從基部取下，切除末端一節(jié)，用導(dǎo)電膠將其兩端黏合到電極兩端，氣味管口與觸角間距為1 cm。將樣品管的末端連接在觸角電位儀氣體刺激控制裝置上，在測(cè)定銹赤扁谷盜對(duì)不同破碎度小麥的觸角電位時(shí)，以空氣為對(duì)照；在測(cè)定銹赤扁谷盜對(duì)小麥揮發(fā)物的觸角電位時(shí)，將檸檬烯、正己醇、壬醛、1-辛烯-3-醇、戊醛、辛醛、庚醛和反式-2-癸烯醛分別用液體石蠟配制成0.1、1.0、10.0 μg/μL 3種不同質(zhì)量濃度的溶液，將10 μL待測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)滴在寬4 mm、長(zhǎng)3 cm濾紙條上，并等待其被濾紙完全吸收，以10 μL石蠟油為對(duì)照。每次刺激0.5 s，間隔為60 s。待顯示器上基線(xiàn)穩(wěn)定后給予刺激，測(cè)試銹赤扁谷盜對(duì)每個(gè)樣品的觸角電位反應(yīng)，每個(gè)處理測(cè)試觸角15根，每個(gè)樣品平均刺激3次。將每一個(gè)樣品測(cè)定值的平均值減去前后2次對(duì)照測(cè)定值的平均值即得觸角電位反應(yīng)的絕對(duì)值。測(cè)試的樣品有完整小麥、破碎小麥、全麥粉，以及常溫下小麥中的主要揮發(fā)物。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及χ2檢驗(yàn)，并采用Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫下小麥揮發(fā)物的種類(lèi)與相對(duì)含量

采用固相微萃取法和氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)不同破碎度小麥揮發(fā)物的種類(lèi)與相對(duì)含量進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。在常溫下當(dāng)年收獲新麥品種208的完整小麥、破碎小麥和全麥粉的揮發(fā)物種類(lèi)分別為17、20、20種，相應(yīng)屬于烷、烯、醛、醇、呋喃5類(lèi)物質(zhì)，其中2, 4-二甲基-庚烷、3, 3-二甲基-己烷和反式-2-癸烯醛在完整小麥中未檢出，說(shuō)明小麥破碎或粉碎后其中的揮發(fā)物成分會(huì)有所增加，增加的原因應(yīng)為原有種皮封鎖的成分在破碎后得到了釋放，且其也有較高的相對(duì)含量。在相對(duì)含量變化上，完整小麥所檢測(cè)出的揮發(fā)物質(zhì)相對(duì)含量在破碎后變化各異。小麥破碎或粉碎后部分物質(zhì)(如壬醛、2, 4-二甲基-庚烷等)相對(duì)含量升高，其可能主要原因?yàn)樽蚜Ｆ扑楹罂臻g開(kāi)放更多，物質(zhì)揮發(fā)也更多所致。破碎后相對(duì)含量減小者則應(yīng)為其總體含量相對(duì)穩(wěn)定，破碎后總體物質(zhì)增加導(dǎo)致其相對(duì)含量減小。

表1 不同破碎度小麥揮發(fā)物成分及相對(duì)含量
Table 1 Relative content of volatile components in different degrees of broken wheat

2.2 銹赤扁谷盜對(duì)不同破碎度小麥的選擇反應(yīng)

銹赤扁谷盜雌、雄成蟲(chóng)對(duì)不同破碎度小麥的選擇反應(yīng)如表2所示，在Y型嗅覺(jué)儀環(huán)境下，試蟲(chóng)對(duì)不同破碎程度小麥表現(xiàn)出不同選擇行為，小麥破碎度大，相應(yīng)的選擇系數(shù)也大，說(shuō)明小麥破碎程度增大會(huì)加大害蟲(chóng)對(duì)其揮發(fā)物的選擇，雌蟲(chóng)對(duì)不同破碎度小麥的選擇系數(shù)最大差值達(dá)0.20。同樣，小麥對(duì)害蟲(chóng)的引誘率和反應(yīng)率也隨小麥破碎度增大而顯著增加，雌蟲(chóng)對(duì)不同破碎度小麥的引誘率最大差值達(dá)0.12，反應(yīng)率最大差值達(dá)0.06。小麥破碎后揮發(fā)物種類(lèi)的增加或某些揮發(fā)物含量的增加增大了對(duì)試蟲(chóng)的引誘作用，相應(yīng)地反應(yīng)率也增大。比較雌、雄蟲(chóng)對(duì)小麥選擇反應(yīng)可見(jiàn)，銹赤扁谷盜同樣破碎狀態(tài)引誘率和反應(yīng)率均為雌蟲(chóng)略大于雄蟲(chóng)，即銹赤扁谷盜雌蟲(chóng)更易受到小麥揮發(fā)物引誘。

表2 銹赤扁谷盜雌、雄成蟲(chóng)對(duì)不同破碎度小麥的選擇反應(yīng)Table 2 Selective responses of females and males of Cryptolestes ferrugineus to different degrees of broken wheat

2.3 銹赤扁谷盜對(duì)不同破碎度小麥的觸角電位反應(yīng)值

圖1顯示，小麥從完整籽粒至全麥粉的破碎度變化使得銹赤扁谷盜雌蟲(chóng)的觸角電位反應(yīng)值從0.131 mV增加至0.147 mV，雄蟲(chóng)的(EAG)從0.091 mV增加至0.120 mV。小麥破碎度增大后，其揮發(fā)物質(zhì)種類(lèi)和數(shù)量增多，相應(yīng)地加大了銹赤扁谷盜觸角電位反應(yīng)值的升高幅度，且同樣情況下雌蟲(chóng)的觸角電位反應(yīng)值大于雄蟲(chóng)的。

圖1 銹赤扁谷盜雌、雄成蟲(chóng)對(duì)不同破碎度小麥的觸角電位反應(yīng)Fig.1 EAG responses of females and males of Cryptolestes ferrugineus to different degrees of broken wheat

2.4 銹赤扁谷盜對(duì)小麥中主要揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)

選取小麥中相對(duì)含量較高的8種主要揮發(fā)性物質(zhì)，檢測(cè)了銹赤扁谷盜雌、雄蟲(chóng)對(duì)其不同濃度單品的觸角電位反應(yīng)，結(jié)果如表3所示。由表3可知，不同小麥揮發(fā)物單品均可以引起銹赤扁谷盜雌、雄成蟲(chóng)不同程度的觸角電位反應(yīng)，且同一物質(zhì)不同質(zhì)量濃度間的觸角電位反應(yīng)值也不同。在測(cè)試的3個(gè)質(zhì)量濃度中，銹赤扁谷盜雌蟲(chóng)對(duì)其中檸檬烯、1-辛烯-3-醇，己醛和戊醛的觸角電位反應(yīng)值隨揮發(fā)物質(zhì)量濃度升高沒(méi)有相應(yīng)顯著增加；對(duì)于正己醇、壬醛、反式-2-癸烯醛和辛醛，隨著揮發(fā)物質(zhì)量濃度的變化，銹赤扁谷盜雌蟲(chóng)的觸角電位反應(yīng)值也發(fā)生相應(yīng)的變化，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到10.0 μg/μL時(shí)銹赤扁谷盜雌蟲(chóng)對(duì)觸角電位反應(yīng)值不再顯著增加。銹赤扁谷盜雄蟲(chóng)對(duì)質(zhì)量濃度為0.1 μg/μL的檸檬烯、己醛和反式-2-癸烯醛觸角電位反應(yīng)值較大，觸角電位反應(yīng)值隨揮發(fā)物質(zhì)量濃度升高沒(méi)有相應(yīng)顯著增加；

壬醛和辛醛質(zhì)量濃度為1.0 μg/μL時(shí)觸角電位反應(yīng)值顯著高于0.1 μg/μL的，揮發(fā)物質(zhì)量濃度持續(xù)增大到10.0 μg/μL后其觸角電位反應(yīng)值無(wú)顯著增加；隨著正己醇和1-辛烯-3醇揮發(fā)物質(zhì)量濃度增加,雄蟲(chóng)對(duì)其觸角電位反應(yīng)值持續(xù)增加，在10.0 μg/μL時(shí)顯著高于0.1 μg/μL的。從整體上看，雌蟲(chóng)對(duì)待測(cè)物質(zhì)觸角電位反應(yīng)值顯著高于雄蟲(chóng)。

3 討論

目前關(guān)于小麥揮發(fā)物的研究多有報(bào)道，高筋小麥和低筋小麥在75 ℃下采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用檢出揮發(fā)性成分107種[20]，在80 ℃下小麥揮發(fā)物檢測(cè)出46種[3]，在75 ℃下從5種小麥粉中測(cè)出揮發(fā)物共54種[21]，這些研究在樣品處理上均為高溫下頂空萃取揮發(fā)物質(zhì)，高溫下所得揮發(fā)物種類(lèi)結(jié)果偏高。谷物的揮發(fā)物與樣品處理溫度有一定關(guān)系[22]，常溫28 ℃下小麥揮發(fā)物只有11種[7]，本研究在常溫28 ℃條件下檢測(cè)出完整小麥、破碎小麥和全麥粉的揮發(fā)物種類(lèi)分別為17、20、20種，進(jìn)一步說(shuō)明常溫下小麥的揮發(fā)物種類(lèi)數(shù)量為10～20種，且小麥破碎程度越高，其揮發(fā)物種類(lèi)也會(huì)有所增加。常溫條件下樣品的揮發(fā)物較少，但常溫更接近實(shí)際害蟲(chóng)發(fā)生的環(huán)境溫度，此條件下利用頂空微萃取法進(jìn)行取樣和成分分析，結(jié)果對(duì)分析引誘害蟲(chóng)的谷物揮發(fā)物成分更有意義。

結(jié)合銹赤扁谷盜對(duì)儲(chǔ)藏谷物感染的習(xí)性，破碎谷物較易于吸引其感染，不同破碎程度對(duì)害蟲(chóng)的引誘作用存在差異[23]。破碎的谷物對(duì)米象有較強(qiáng)吸引力，且不同程度的脫殼和破碎度對(duì)米象的吸引效果也不同[24]。本研究表明，小麥破碎度增加后不僅對(duì)害蟲(chóng)的引誘作用增強(qiáng)，而且相應(yīng)的觸角電位值也發(fā)生顯著性變化，即破碎程度越高，對(duì)害蟲(chóng)的引誘效果越顯著，觸角電位反應(yīng)也更明顯，可能與其揮發(fā)物關(guān)系更密切。鑒于小麥破碎度高時(shí)更易于引誘害蟲(chóng)，小麥儲(chǔ)藏中應(yīng)盡量減少破碎粒率和不完善粒率。研究表明壬醛、戊醛、庚醛、己酸、1-辛烯-3-醇、異辛醇、3-辛酮等化合物對(duì)銹赤扁谷盜具有吸引作用[25-27]，不同破碎度小麥對(duì)銹赤扁谷盜表現(xiàn)出不同的引誘效果，可能與其中含有的特有成分有關(guān)，其中2, 4-二甲基-庚烷、3, 3-二甲基-己烷和反式-2-癸烯醛在完整小麥中未檢出。不同谷物的揮發(fā)物在組成和含量上有所不同，從而形成其特定的氣味，這些特定氣味在昆蟲(chóng)選擇寄主時(shí)具有重要行為導(dǎo)向作用。銹赤扁谷盜雌、雄成蟲(chóng)均對(duì)小麥中8種不同濃度揮發(fā)物產(chǎn)生不同程度的電生理反應(yīng)，雌、雄成蟲(chóng)對(duì)待測(cè)揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)也存在差異，說(shuō)明同一揮發(fā)物在不同性別害蟲(chóng)中可能行使的生理功能也各不相同。銹赤扁谷盜在取食選擇過(guò)程中，其行為可能與這些揮發(fā)物有關(guān)，也可能與其協(xié)同效應(yīng)有關(guān)，此類(lèi)問(wèn)題有待做進(jìn)一步的研究。