李 靜，耿志軍，鄭 晶，王 濤，應(yīng)沖濤，郭 普

碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae,CRE)的臨床分離率不斷增加，其治療已成為我國(guó)抗感染治療的嚴(yán)峻問(wèn)題。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE最重要的耐藥機(jī)制之一[1]。目前，研究發(fā)現(xiàn)碳青霉烯酶主要包括A類(lèi)酶(KPC)、B類(lèi)酶(IMP、NDM及VIM等)及D類(lèi)酶(OXA-48)[2]。臨床試驗(yàn)證明新型β-內(nèi)酰胺類(lèi)/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物等抗生素對(duì)大多數(shù)產(chǎn)A類(lèi)和D類(lèi)酶CRE菌株有效，但對(duì)B類(lèi)酶無(wú)效。因此，區(qū)分CRE產(chǎn)酶類(lèi)型對(duì)合理選擇抗生素及臨床治療具有重要意義。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)碳青霉烯酶的方法主要有紙片協(xié)同試驗(yàn)、mCIM(modified carbapenem inactivation method)和eCIM(EDTA-carbapenem inactivation method)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)、改良Hodge實(shí)驗(yàn)、顯色培養(yǎng)和基因檢測(cè)方法等。其中mCIM和eCIM聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室目前臨床使用較多的碳青霉烯酶檢測(cè)方法[3]。但該實(shí)驗(yàn)需要兩階段的孵育培養(yǎng)，結(jié)果時(shí)效性較差，且無(wú)法準(zhǔn)確給出酶的分型結(jié)果。膠體金免疫層析法是最新研發(fā)的碳青霉烯酶快速檢測(cè)方法，該法將5種碳青霉烯酶的單克隆抗體與膠體金偶聯(lián)，并固定于醋酸纖維素膜上,用于培養(yǎng)后獲取的細(xì)菌樣本中碳青霉烯酶的體外定性檢測(cè)。本研究以蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院所收集的CRE菌株為研究對(duì)象，通過(guò)膠體金免疫層析法檢測(cè)CRE菌株的產(chǎn)碳青霉烯酶類(lèi)型，并與基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性分析，評(píng)估分析膠體金免疫層析法在CRE產(chǎn)碳青霉烯酶類(lèi)型檢測(cè)中的應(yīng)用效能。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2017年7月至2020年12月期間臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌，對(duì)厄他培南、亞胺培南耐藥，剔除同一病人同一部位分離的腸桿菌科菌株，共收集細(xì)菌80株；另外收集對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感的腸桿菌科細(xì)菌作為對(duì)照菌株，共計(jì)21株。

1.2 主要儀器與試劑 凝膠成像儀(Bio-Rad公司)、PCR 擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司)、冷凍高速離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司)、干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)、哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)、西班牙瓊脂糖(Biowest)、GeneGreen核酸染料(北京天根生化科技有限公司)、2×Taq PCR Mix(北京天根生化科技有限公司)、Trans2K DNA Marker(北京全式金生物)、碳青霉烯酶基因PCR引物自上海生工生物合成、 1×TBE 緩沖液(北京天根生化科技有限公司)、亞胺培南紙片(10 mg，OXOID公司)、細(xì)菌培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司)、生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)、含珠菌種保存管(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、碳青霉烯酶檢測(cè)試劑盒(長(zhǎng)沙中生眾捷生物技術(shù)有限公司)、渦旋儀(合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 PCR檢測(cè)方法 將保存的菌株接種到血瓊脂平板上，在37 ℃、5%CO2細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)隔夜培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)蘇。采用加熱煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，采用10 μL接種環(huán)挑取一環(huán)細(xì)菌，置于1 mL無(wú)菌去離子水中，于干式恒溫器中煮沸10 min，離心12 000 r/min，10 min，將含DNA的上清液轉(zhuǎn)移至新EP管中，待進(jìn)行PCR檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5個(gè)常見(jiàn)的碳青霉烯酶基因，基因種類(lèi)及引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件和PCR反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，100 V，30 min，于凝膠成像儀中曝光并拍照。

表1 PCR引物序列表

1.4 膠體金免疫層析法檢測(cè) 膠體金免疫層析法檢測(cè)CRE碳青霉烯的方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將碳青霉烯酶檢測(cè)卡盒和提取緩沖液平衡至室溫。于EP管中加入150 μL提取緩沖液，使用1 μL接種環(huán)取一環(huán)細(xì)菌樣本置于含提取緩沖液的EP管中。樣本使用渦旋儀混合震蕩5 s使標(biāo)本混合均勻(如果樣本黏稠，震蕩3 min并室溫靜置10 min后進(jìn)行檢測(cè))。取100 μL樣本混合液，加入檢測(cè)卡盒的樣本孔中，室溫放置15 min，讀取結(jié)果。試劑檢測(cè)結(jié)果解釋?zhuān)?1)陰性結(jié)果，僅在C線區(qū)域出現(xiàn)一條紅線，則樣本中不含所測(cè)5種碳青霉烯酶或含量低于檢測(cè)線，判讀為陰性結(jié)果。(2)陽(yáng)性結(jié)果，在C線區(qū)域中出現(xiàn)一條紅線并且在K、O、V、I、N檢測(cè)線區(qū)域中出現(xiàn)一條或多條紅線，判讀為陽(yáng)性結(jié)果，樣本中含有一種或多種碳青霉烯酶。(3)無(wú)效結(jié)果，在C線區(qū)域未出現(xiàn)紅線，則測(cè)試結(jié)果無(wú)效。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以PCR檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算膠體金免疫層析法的敏感性、特異性，Kappa值>0.750，說(shuō)明一致性程度較好。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離CRE菌株分布 101例臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌，主要來(lái)自ICU、急診科等臨床科室；體外藥敏試驗(yàn)表型為CRE 80株(包括肺炎克雷伯菌60株、陰溝腸桿菌7株、大腸埃希菌13株)，對(duì)碳青霉烯酶類(lèi)抗生素敏感的菌株21株(包括肺炎克雷伯菌13株、陰溝腸桿菌2株、大腸埃希菌5株、產(chǎn)氣腸桿菌1株)。菌株分布結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 臨床分離CRE菌株分布

2.2 CRE碳青霉烯類(lèi)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 80株CRE菌株中碳青霉烯酶基因陽(yáng)性為79株，碳青霉烯酶基因陰性為1株，其中檢測(cè)到KPC基因型61株(76.25%)，NDM基因型10株(12.50%)，IMP基因型6株(7.50%)，VIM基因型2株(2.50%)；未檢測(cè)到OXA-48基因型，21株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感的細(xì)菌均未檢測(cè)到耐藥基因。代表性CRE菌株基因型檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 膠體金免疫層析法檢測(cè) 經(jīng)膠體金免疫層析法檢測(cè)，結(jié)果顯示，61株KPC基因型均為陽(yáng)性，10株NDM基因型均為陽(yáng)性，6株IMP基因型均為陽(yáng)性，2株VIM基因型均為陽(yáng)性，膠體金免疫層析法對(duì)CRE的篩選敏感性為100%，特異性為100%，四種酶型分別與PCR結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)分析，Kappa值均為1，完全一致。具體分析結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

目前，臨床感染性疾病中革蘭陰性細(xì)菌感染率約占50%，碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物作為最后一道防線已被臨床廣泛應(yīng)用。細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，革蘭陰性桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥率逐年增加[5-6]。目前的研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，腸桿菌科細(xì)菌主要通過(guò)產(chǎn)碳青霉烯酶發(fā)揮對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，碳青霉烯酶依據(jù)Ambler分類(lèi)主要分為三類(lèi)，包括A類(lèi)酶、B類(lèi)酶和D類(lèi)酶。A類(lèi)酶在含有絲氨酸殘基的部位進(jìn)行催化作用，又稱(chēng)為絲氨酸酶，其中KPC基因是我國(guó)最常見(jiàn)的基因型；B類(lèi)酶又稱(chēng)金屬酶，可被 EDTA 等含有金屬離子螯合劑抑制，包括 IMP、VIM、NDM等基因，IMP 基因是目前報(bào)道的最早發(fā)現(xiàn)的金屬酶，其水解碳青霉烯類(lèi)抗生素的能力較強(qiáng)；D類(lèi)酶對(duì)亞胺培南具有較高水解活性，在腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的唯一基因型是OXA-48，目前臨床分離的產(chǎn)D類(lèi)酶菌株較少[9-10]。臨床試驗(yàn)證明新型β-內(nèi)酰胺類(lèi)/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物等抗生素對(duì)大多數(shù)產(chǎn)A類(lèi)和D類(lèi)酶CRE菌株有效，但對(duì)B類(lèi)酶無(wú)效。因此，區(qū)分CRE產(chǎn)酶類(lèi)型對(duì)合理選擇抗生素及臨床治療具有重要意義。

表3 PCR法與膠體金免疫層析法結(jié)果對(duì)比分析

本研究針對(duì)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2017年7月至2020年12月收集的CRE菌株，進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，在80株CRE菌株中，79株檢測(cè)出耐碳青霉烯酶基因，其中表達(dá)KPC基因有61株，表達(dá)NDM基因有10株，表達(dá)IMP基因有6株，表達(dá)VIM基因有2株；未檢測(cè)到OXA-48基因型。本研究中檢測(cè)到的最主要基因型是KPC，由此可見(jiàn)本地區(qū)臨床分離的CRE菌株KPC仍是最主要的碳青霉烯酶基因型，與前期報(bào)道[11-12]基本一致。另外，我們還檢測(cè)到NDM、IMP及VIM基因型，本研究中的10株產(chǎn)NDM菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素在內(nèi)的其他藥物幾乎全部耐藥。我國(guó)海南、武漢等地均有從腸桿菌科細(xì)菌中檢出NDM的報(bào)道[11]。由于抗生素的不合理使用，目前CRE的耐藥機(jī)制多樣，除產(chǎn)碳青霉烯酶外，還包括外膜蛋白的缺失或合并產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及藥物外排泵高度表達(dá)等[13]。本研究中1株碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥菌株的PCR法及膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，可能原因是該菌株通過(guò)產(chǎn)生其他碳青霉烯酶(OXA-23、GIM、SPM及GES等)或存在其他耐藥機(jī)制，需要我們進(jìn)一步分析研究。

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)碳青霉烯酶的方法主要有紙片協(xié)同試驗(yàn)、mCIM和eCIM聯(lián)合實(shí)驗(yàn)、改良Hodge實(shí)驗(yàn)、顯色培養(yǎng)和PCR法等。改良Hodge試驗(yàn)及mCIM試驗(yàn)是2017版美國(guó)臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的碳青霉烯酶表型篩選方法。而mCIM和eCIM聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室是目前臨床使用較多的碳青霉烯酶檢測(cè)方法。膠體金免疫層析法是最新研發(fā)的碳青霉烯酶快速檢測(cè)方法，該法將KPC、IMP、VIM、NDM和OXA-48型5種碳青霉烯酶的單克隆抗體與膠體金偶聯(lián)，并固定于醋酸纖維素膜上，用于培養(yǎng)后獲取的細(xì)菌樣本中KPC、IMP、VIM、NDM和OXA-48型5種碳青霉烯酶的體外定性檢測(cè)，可快速鑒定細(xì)菌樣本中是否存在5種碳青霉烯酶中一種或幾種，從而鑒定感染病人是否對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素具有耐藥性[14]。目前該方法在中國(guó)尚未作為臨床常規(guī)檢測(cè)CRE碳青霉烯酶，其檢測(cè)效能尚需進(jìn)一步評(píng)價(jià)，本研究采用膠體金免疫層析法對(duì)79株CRE菌株進(jìn)行產(chǎn)酶檢測(cè)，并與PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性分析，結(jié)果證實(shí)膠體金免疫層析法對(duì)KPC、IMP、VIM、NDM的檢測(cè)敏感性高(100%)、特異性強(qiáng)(100%)，更重要的是操作簡(jiǎn)單快速，僅需20 min左右即可鑒定出CRE產(chǎn)碳青霉烯酶類(lèi)型。

總之，膠體金免疫層析法是一種操作簡(jiǎn)便、快速高效的CRE碳青霉烯酶檢測(cè)方法，該法檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型的敏感性和特異性較高，對(duì)流行病學(xué)調(diào)查、感染控制及臨床抗菌藥物管理優(yōu)化均具有重要的意義。