魏欣宇，高 鵬，劉佳欣，王文銳，楊清玲，陳昌杰

據(jù)CA最新統(tǒng)計(jì)[1]，全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)，成為世界第一大癌癥，嚴(yán)重威脅了女性健康。乳腺癌的診斷和治療正在向個(gè)性化、精準(zhǔn)化發(fā)展，如化療、內(nèi)分泌治療和靶向藥物[2]。但目前面臨的重要問(wèn)題是，乳腺癌耐藥性的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移常導(dǎo)致治療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)[3]。因此，闡明乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的詳細(xì)機(jī)制對(duì)于尋找潛在治療靶點(diǎn)和乳腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。外泌體作為一種運(yùn)輸載體，大小在40～160 nm，在基質(zhì)和癌細(xì)胞之間傳遞核酸和蛋白質(zhì)，介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊，從而影響癌細(xì)胞的生物活性。由于富含各種生物分子，外泌體為生物液體檢測(cè)提供了一種多組分診斷指標(biāo)[4-6]。其中，microRNAs是內(nèi)源性的小非編碼RNA，具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的功能。生理過(guò)程和病理，包括癌癥、心血管和代謝性疾病都高度依賴miRNA。癌細(xì)胞釋放的外泌體miRNA可以介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞的表型改變，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和耐藥。本研究主要探討外泌體源性miR-5585-5p的表達(dá)情況和其介導(dǎo)的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所得，課題組前期成功構(gòu)建紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKBR-3/PR;胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司;β-actin、P-GP、MRP 抗體購(gòu)自Affnity;細(xì)胞凋亡試劑盒、BCA試劑盒購(gòu)自碧云天公司；外泌體提取試劑盒購(gòu)自貝貝生物科技有限公司；外泌體染料PKH26、PKH67購(gòu)自上海宇玫博公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%，胰酶消化離心進(jìn)行傳代。

1.2.2 外泌體的提取 細(xì)胞融合度至50%，PBS清洗細(xì)胞，換無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用超速離心法提取外泌體，根據(jù)外泌體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 外泌體攝取實(shí)驗(yàn) 以PKH26標(biāo)記外泌體，根據(jù)說(shuō)明書(shū)配制熒光染料，與提取的外泌體共孵育10 min，再與SKBR-3細(xì)胞共培養(yǎng)8 h，熒光顯微鏡觀察并拍攝。

1.2.4 轉(zhuǎn)染miR-5585-5p抑制劑 將乳腺癌耐藥細(xì)胞接種至六孔板中，放入 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 50%～70%，棄掉舊培養(yǎng)基，PBS清洗后實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入1.5 mL 無(wú)血清培養(yǎng)基和500 μL配制的轉(zhuǎn)染試劑(A液：250 μL Opti-MEM+5 μL Lipofectamine2000;B液：250 μL Opti-MEM+5 μL inhibitor；靜置5 min后，B液加入A液，室溫孵育20 min)。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)核酸表達(dá)量 從細(xì)胞和外泌體中提取總RNA(Trozal法)，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GAPDH作為內(nèi)參，所用的引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)參數(shù)為 95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，55個(gè)循環(huán)。獲得的數(shù)據(jù)運(yùn)用2-ΔΔCt計(jì)算表達(dá)量。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量 收集細(xì)胞，洗滌后加入裂解液冰上裂解30 min，離心后獲得總蛋白。BCA法測(cè)定總蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，70 V電泳至濃縮膠和分離膠交界處，調(diào)整電壓100 V電泳至溴酚藍(lán)條帶到達(dá)分離膠底部，停止電泳；轉(zhuǎn)膜時(shí)將PVDF膜預(yù)先放入甲醇中激活，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h;隨后將PVDF 膜放入封閉液中搖床孵育2 h，洗膜(每次10 min，3次)，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，第2天孵二抗(37 ℃，2 h)，洗膜后曝光。

1.2.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。按照實(shí)驗(yàn)分組，各組上室加入含有相同細(xì)胞數(shù)(4×104/孔)的細(xì)胞懸液，并用無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)至200 μL;下室加入 600 μL含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽小心擦去上室的培養(yǎng)基以及膜上部未穿過(guò)的細(xì)胞，4%多聚甲醇固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗3次，自然晾干后，倒置顯微鏡隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野下細(xì)胞數(shù)目并拍照記錄。

1.2.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種在6孔板中，5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)按照實(shí)驗(yàn)分組處理，繼續(xù)孵育24 h。用不含EDTA 的胰酶將細(xì)胞消化后離心(1 000 r/min)5 min，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞 2 次。200 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，先加入5 μL FITC，再加入10 μL PI，染色后室溫避光孵育30 min，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 耐藥細(xì)胞源性外泌體被乳腺癌細(xì)胞攝取 外泌體攝取實(shí)驗(yàn)表明PKH26標(biāo)記的紅色外泌體能夠被乳腺癌細(xì)胞攝取至胞內(nèi)(見(jiàn)圖1)。

2.2 耐藥細(xì)胞源性外泌體促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥表型 將從耐藥細(xì)胞上清液中提取的外泌體與乳腺癌親本細(xì)胞共培養(yǎng)。qRT-PCR結(jié)果顯示，相對(duì)于乳腺癌親本細(xì)胞，耐藥細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)組的耐藥標(biāo)志物表達(dá)均升高(P<0.01)(見(jiàn)表2)。Transwell 和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與乳腺癌親本細(xì)胞組相比，耐藥細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)組的乳腺癌細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(P<0.01)，癌細(xì)胞凋亡率下降(P<0.01)(見(jiàn)圖2～3、表3)。

表2 在外泌體共培養(yǎng)組中耐藥相關(guān)基因表達(dá)水平升高

表3 耐藥細(xì)胞源性外泌體對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力和凋亡的影響

2.3 miR-5585-5p在耐藥細(xì)胞株及其外泌體中高表達(dá) 與乳腺癌細(xì)胞表達(dá)量(1.00±0.00)相比，miR-5585-5p在耐藥細(xì)胞中表達(dá)(2.08±0.35)明顯升高(t=5.35，P<0.01)；同時(shí)，分別從SKBR-3和SKBR-3/PR細(xì)胞中提取外泌體，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，紫杉醇耐藥的乳腺癌細(xì)胞外泌體中miR-5585-5p的表達(dá)量升高[(1.00±0.00)vs(3.03±0.49)](t=3.56，P<0.05)。

2.4 miR-5585-5p抑制劑逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥細(xì)胞的耐藥性 在耐藥細(xì)胞中，與未轉(zhuǎn)染抑制劑的control組相比，miR-5585-5p inhibitor組耐藥性降低(P<0.01)，耐藥相關(guān)蛋白PGP和MRP表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，抑制劑組遷移能力減弱(P<0.01)，細(xì)胞凋亡增多(P<0.01)(見(jiàn)圖4～6、表4)。

表4 miR-5585-5p抑制劑抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞耐藥指標(biāo)的比較

2.5 miR-5585-5p通過(guò)外泌體進(jìn)入到乳腺癌細(xì)胞中 外泌體示蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組CY3標(biāo)記的miR-5585-5p通過(guò)外泌體進(jìn)入到乳腺癌細(xì)胞內(nèi)(見(jiàn)圖7)。

2.6 外泌體差異表達(dá)miR-5585-5p生物學(xué)活性分析 相對(duì)于未轉(zhuǎn)染抑制劑的外泌體共培養(yǎng)組，抑制劑外泌體組親本細(xì)胞的耐藥相關(guān)基因PGP、BCRP和MRP的表達(dá)量降低(P<0.01)，遷移能力降低(P<0.01)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.01)(見(jiàn)圖8～9、表5)。

表5 外泌體差異表達(dá)miR-5585-5p生物學(xué)活性指標(biāo)的比較

3 討論

盡管乳腺癌的篩查、診斷和治療取得了進(jìn)展，但乳腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然存在并困擾著人們。在芳香化酶抑制劑抗性細(xì)胞中，Ⅱ型角蛋白拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域經(jīng)過(guò)表觀遺傳重編程，導(dǎo)致角蛋白-80上調(diào)，進(jìn)而增加黏附，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲[7]。耐藥通常伴隨著癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而出現(xiàn)。乳腺癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，與通過(guò)轉(zhuǎn)移miR-21到破骨細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移前生態(tài)位有關(guān)[8]。microRNAs可以調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，在生長(zhǎng)和化療耐藥性中發(fā)揮作用。此外，外泌體通過(guò)與目標(biāo)細(xì)胞膜的融合啟動(dòng)細(xì)胞與細(xì)胞之間的通信，傳遞包括miRNAs和蛋白質(zhì)在內(nèi)的功能分子。PAN等[9]證實(shí)，miR-221-3p在ADR耐藥MCF-7細(xì)胞衍生外泌體中過(guò)表達(dá)可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)ADR敏感MCF-7(MCF-7/S)細(xì)胞的ADR耐藥。CHEN等[10]證實(shí)吉非替尼敏感細(xì)胞中miR-7的表達(dá)明顯高于吉非替尼耐藥細(xì)胞。外泌體從敏感細(xì)胞向吉非替尼耐藥細(xì)胞傳遞高表達(dá)的miR-7，逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥。而且，miR-7的高表達(dá)與肺癌病人對(duì)吉非替尼治療的強(qiáng)響應(yīng)和較長(zhǎng)的生存時(shí)間有關(guān)。SANTOS等[11]對(duì)miR-155的功能測(cè)定與耐藥細(xì)胞的外泌體轉(zhuǎn)移到受體敏感細(xì)胞中相對(duì)應(yīng)說(shuō)明外泌體可能部分通過(guò)miR-155的外泌體轉(zhuǎn)移介導(dǎo)了對(duì)敏感細(xì)胞的抗性和遷移能力。

本研究首先從紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞中提取外泌體，并將其與乳腺癌親本細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞分泌的外泌體能夠促進(jìn)親本細(xì)胞產(chǎn)生耐藥表型。通過(guò)外泌體miRNAs測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)其中miR-5585-5p在耐藥細(xì)胞株和其外泌體中表達(dá)均升高。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以耐藥細(xì)胞SKBR-3/PR為研究對(duì)象，抑制miR-5585-5p的表達(dá)發(fā)現(xiàn)miR-5585-5p抑制劑能逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的耐藥性，抑制耐藥細(xì)胞遷移并誘導(dǎo)其凋亡。隨后，對(duì)miR-5585-5p進(jìn)行標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)其通過(guò)外泌體進(jìn)入到親本細(xì)胞內(nèi)，提取轉(zhuǎn)染抑制劑組的外泌體，與未轉(zhuǎn)染抑制劑組相比，抑制劑組乳腺癌細(xì)胞的耐藥性降低，遷移能力降低，而細(xì)胞凋亡增多。

綜上，耐藥細(xì)胞可能通過(guò)外泌體遞送其產(chǎn)生的大量miR-5585-5p至親本細(xì)胞，并誘導(dǎo)親本細(xì)胞產(chǎn)生耐藥表型。但其中具體的機(jī)制和外泌體miR-5585-5p作為臨床乳腺癌腫瘤標(biāo)志的可行性還需進(jìn)一步研究。