鄧 敏，侯濱芬，陳曉東

胃癌是最常見的癌癥類型之一，根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2020 年全世界胃癌新發(fā)病例占惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的第5位，死亡病例居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第 4 位，其中 43.9% 發(fā)病病例和 48.6% 死亡病例發(fā)生在中國[1]。根據(jù)我國最新胃癌流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2003-2015年胃癌年齡標(biāo)化生存率雖然均呈不同程度增加，但仍顯著低于日本和韓國[2]。目前胃癌仍以手術(shù)治療為主，臨床亟需尋找安全有效的治療靶點(diǎn)并了解其對胃癌的作用機(jī)制至關(guān)重要，是目前研究關(guān)注的熱點(diǎn)。

大黃酚是中藥大黃的主要活性成分之一，是一種天然蒽醌類化合物。研究[3-6]證實(shí)，大黃酚通過誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如核因子κB、活性氧、蛋白激酶B、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶等發(fā)揮抗腫瘤作用。我們先前研究[7]也表明大黃酚可通過靶向核心蛋白聚糖(decorin，DCN)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞活性。然而，大黃酚治療胃癌的潛在分子機(jī)制仍然知之甚少。NLRP3炎癥小體是一種由NLRP3、ASC和caspase-1組成的細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物，通過觸發(fā)caspase-1、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟以執(zhí)行炎癥反應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[8]，這可能與NLRP3炎癥小體的另一個關(guān)鍵作用觸發(fā)焦亡相關(guān)[9]。本研究通過觀察大黃酚對胃癌細(xì)胞焦亡的影響，并進(jìn)一步探討在此過程中大黃酚對NLRP3炎癥小體的調(diào)控作用及其機(jī)制，以期為其在胃癌治療中的潛在價值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人胃癌細(xì)胞株MKN28(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京)；大黃酚[純度≥98.0%(HPLC),Sigma-Aldrich,美國];DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco，美國);二甲基亞砜(DMSO)(久億化學(xué)試劑有限公司，中國);FAM-FLICA caspase-1試劑盒(ImmunoChemistry Technologies，美國);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(建成生物科技有限公司，中國);NLRP3、cleaved caspase-1、supernatant IL-1β、lysate IL-1β和 IL-1β(Abcam,Shanghai,美國) ；Trizol(Invitrogen)；PrimeScriptTMRT試劑盒(Applied Biosystems，USA)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞株MKN28細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清-青鏈霉素雙抗溶液)。置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用DMSO將大黃酚制成儲備溶液，使用生長培養(yǎng)基稀釋成系列濃度(2、5和10 μmol/L)。以含有0.1%DMSO的正常生長培養(yǎng)基作為對照。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化離心后，以0.5×104個/孔的密度鋪于96孔板中。處理組用含有不同濃度大黃酚(0、2、5、10 μmol/L)的培養(yǎng)基，空白對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液。在37 ℃的5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或48 h。采用CCK-8檢測不同濃度大黃酚、不同處理時間(24、48 h)的細(xì)胞增殖活力。于各時間點(diǎn)每孔加入10 μL CCK8試劑并置于37 ℃孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的吸光度值(OD450)。每個處理組設(shè)3個平行孔，另設(shè)陰性對照和空白調(diào)零孔。存活率(%)=[OD450處理組-OD450空白組]/[OD450對照組-OD450空白組]×100%。以時間為橫坐標(biāo),細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) MKN28細(xì)胞以1 000個/孔接種于6孔板中，37 ℃孵育 24 h 后，以不同濃度的大黃酚(0、5和10 μmol/L)培養(yǎng)細(xì)胞2周，期間每隔 3 d 更換 1 次含有大黃酚的培養(yǎng)液。2周后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞1次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，然后用0.1%的結(jié)晶紫室溫染色30 min，PBS洗滌細(xì)胞3次之后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照，Image-Pro Plus計數(shù)各組克隆數(shù)，細(xì)胞數(shù)>15個計為1個克隆。

1.2.4 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞焦亡 將細(xì)胞傳代至 6 孔板，待細(xì)胞貼壁后更換含有不同濃度大黃酚(0、5和10 μmol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng) 12 h。使用胰酶消化、離心收集細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，隨后參照FAM-FLICA caspase-1分析試劑盒說明，對細(xì)胞中活化的caspase-1和碘化丙啶(PI)進(jìn)行雙陽性染色來評估細(xì)胞凋亡。每組設(shè)3個重復(fù)組，同時以DMSO作為對照組。

1.2.5 LDH試驗(yàn)檢測 將MKN28細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中孵育，并進(jìn)行如下分組：含0.1%DMSO的培養(yǎng)基組(對照組)，不經(jīng)caspase-1選擇性抑制劑VX-765 (10 nmol/L) 或 NLRP3選擇性抑制劑MCC950 (100 nmol/L)預(yù)處理的5 μmol/L和10 μmol/L大黃酚組，經(jīng)VX-765(10 nmol/L) 或MCC950 (100 nmol/L)預(yù)處理的5 μmol/L和10 μmol/L大黃酚組，抑制劑對照組。使用酶標(biāo)儀檢測吸光值并計算LDH釋放率。

1.2.6 Western blotting檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理結(jié)束后，PBS 清洗并用胰酶消化，收集細(xì)胞沉淀，用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后將蛋白煮沸12 min變性。以20 μg蛋白上樣至10%的聚丙烯酰胺凝膠，通過SDSPAGE將蛋白混合樣分離。再250 mA轉(zhuǎn)膜2 h，用5%脫脂牛奶封閉90 min，TBST清洗3次，每次5 min。加入特異性一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗4次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育 2 h，TBST清洗4次，每次10 min。以GAPDH為內(nèi)參照，ECL曝光顯影。

1.2.7 實(shí)時定量PCR (qRT-PCR)檢測 Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞NLRP3、cleaved caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)，引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照說明書。β-actin基因作為內(nèi)參對照。每組NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β基因的相對表達(dá)量按2-△△Ct法計算。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大黃酚對胃癌細(xì)胞MKN28細(xì)胞的存活和克隆形成能力的影響 大黃酚(2、5和10 μmol/L)處理MKN28細(xì)胞24 h時，大黃酚以劑量和時間依賴的方式降低細(xì)胞活性(P<0.01)；48 h后與0 μmol/L組比較，大黃酚2 μmol/L和5 μmol/L濃度細(xì)胞活性降低(P<0.01)，10 μmol/L濃度時又恢復(fù)到0 μmol/L水平(P>0.05)(見表2)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃酚處理后抑制了MKN28細(xì)胞的集落形成能力(P<0.01)(見表3)。

表2 大黃酚對MKN28細(xì)胞增殖活性的影響

表3 大黃酚對MKN28細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.2 大黃酚對胃癌細(xì)胞MKN28焦亡的影響 大黃酚可引起細(xì)胞形態(tài)改變，包括細(xì)胞密度降低、細(xì)胞變圓和細(xì)胞漂浮(見圖1)。流式細(xì)胞儀檢測caspase-1和PI陽性細(xì)胞百分率，結(jié)果顯示與 0 μmol/L大黃酚組相比，5 μmol/L和10 μmol/L大黃酚組caspase-1活化細(xì)胞數(shù)逐漸升高，呈劑量依賴性(F=221.47,P<0.01)(見圖2)。

2.3 大黃酚對胃癌細(xì)胞MKN28細(xì)胞中 NLRP3炎性小體表達(dá)的影響 與0 μmol/L組相比，5 μmol/L和10 μmol/L大黃酚組，MKN28細(xì)胞NLRP3、caspase-1 和 IL-1β的mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)(見表4)；NLRP3、cleaved caspase-1、上清IL-1β、裂解IL-1β的蛋白水平均明顯升高(P<0.01)(見表5)。

表4 大黃酚對MKN28細(xì)胞中NLRP3、caspase-1及IL-1β的mRNA表達(dá)量的影響

表5 大黃酚對MKN28細(xì)胞中NLRP3、caspase-1及IL-1β的蛋白表達(dá)量的影響

2.4 VX-765、MCC950對MKN28細(xì)胞焦亡及NLRP3炎性小體表達(dá)的影響 與大黃酚(10 μmol/L)組比較，大黃酚(10 μmol/L)+VX-765組的MKN28細(xì)胞中LDH釋放和caspase-1活化細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.01)(見表6)，IL-1β的mRNA表達(dá)和上清IL-1β、 裂解IL-1β的蛋白表達(dá)均下降(P<0.01)(見表7)。

表6 caspase-1抑制劑VX-765對大黃酚誘導(dǎo)細(xì)胞LDH釋放及caspase-1/PI雙染陽性細(xì)胞比例的影響

表7 caspase-1抑制劑VX-765對大黃酚誘導(dǎo)細(xì)胞IL-1β的mRNA以及蛋白表達(dá)量的影響

與大黃酚(10 μmol/L)組相比，大黃酚(10 μmol/L)+MCC950組的MKN28細(xì)胞中LDH釋放和caspase-1活化細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.01)(見表8)，cleaved caspase-1蛋白表達(dá)水平、IL-1β mRNA表達(dá)及上清 IL-1β、裂解 IL-1β的蛋白表達(dá)均下降(P<0.01)(見表9)。

表8 NLRP3抑制劑MCC950對大黃酚誘導(dǎo)細(xì)胞LDH釋放以及caspase-1/PI雙染陽性細(xì)胞比例的影響

表9 NLRP3抑制劑MCC950對大黃酚誘導(dǎo)細(xì)胞caspase-1活化、IL-1β的mRNA以及蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

我國胃癌病人臨床確診時常常已處于晚期，治療手段包括外科手術(shù)治療、化療和分子靶向治療。近年來盡管外科治療技術(shù)和化療方案得到提高和改進(jìn)，但療效并不盡人意，我國胃癌疾病負(fù)擔(dān)仍較嚴(yán)重。目前研究發(fā)現(xiàn)中藥有效成分在腫瘤輔助治療中不僅具有抗癌活性，而且不良反應(yīng)少，因此在抗腫瘤領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)。

研究表明，大黃酚可以多途徑、多環(huán)節(jié)、多階段引起多種癌細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞死亡，因此可能成為天然有效的抗癌化療藥物；大黃酚靶向調(diào)節(jié)核因子κB信號通路，抑制乳腺癌細(xì)胞活性，促進(jìn)凋亡[3]；大黃酚也可以通過刺激活性氧，誘導(dǎo)線粒體鈣超載，并激活MAPK途徑，從而抑制卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[5]；大黃酚還可通過靶向DCN促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體凋亡[7]。然而，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，大黃酚是否具有抗癌作用，以及其如何調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞生長的潛在機(jī)制尚并不清楚。本研究通過將不同濃度大黃酚作用于胃癌細(xì)胞(MKN28和AGS細(xì)胞)，從而觀察大黃酚對胃癌細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用并對其可能機(jī)制進(jìn)行了探討。本研究發(fā)現(xiàn)，采用不同濃度大黃酚處理胃癌細(xì)胞(MKN28)后，與對照組相比，大黃酚以劑量和時間依賴的方式降低細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞的集落形成能力。結(jié)果提示大黃酚抑制了MKN28細(xì)胞的增殖，說明大黃酚在胃癌的治療中具有抑癌作用。

NLRP3炎性小體是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，是體內(nèi)主要的炎癥調(diào)控元件，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[10]。NLRP3炎性小體一方面介導(dǎo)caspase-1的激活，促進(jìn)包括前體IL-1β和前體IL-18在內(nèi)的細(xì)胞因子前體的成熟和分泌[11]，另一方面調(diào)節(jié)caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡，在應(yīng)激、病理和炎癥條件下誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[12]。研究[13]表明，中藥可以通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體從而參與疾病的發(fā)展過程。本研究中，大黃酚可引起MKN28細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞焦亡。大黃酚處理后MKN28細(xì)胞中NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA水平以及NLRP3、cleaved caspase-1、上清 IL-1β、裂解IL-1β的蛋白水平均顯著升高,提示大黃酚可能通過激活胃癌細(xì)胞的焦亡從而抑制細(xì)胞增殖。進(jìn)一步應(yīng)用caspase-1抑制劑VX-765和NLRP3抑制劑MCC950處理后，相對于大黃酚組，cleaved caspase-1蛋白表達(dá)水平、IL-1β mRNA表達(dá)以及上清 IL-1β、裂解 IL-1β蛋白表達(dá)均顯著下降，提示兩者均可消除大黃酚對細(xì)胞焦亡和NLRP3炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從而說明2種抑制劑均可有效減弱大黃酚誘導(dǎo)的MKN28細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活。同時，抑制劑處理后，相對于大黃酚組，MKN28細(xì)胞中LDH釋放及caspase-1活化細(xì)胞數(shù)均顯著降低。因此，該結(jié)果更進(jìn)一步說明了，抑制NLRP3炎癥小體的激活削弱了大黃酚對胃癌細(xì)胞抑癌作用。但之前的研究[14]發(fā)現(xiàn)，在小鼠的腦缺血/再灌注過程中，大黃酚可以阻斷NLRP3炎性小體的激活，從而防止病程進(jìn)展。由此說明，大黃酚對NLRP3炎性小體的影響可能與其微環(huán)境有關(guān)，尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在其對腫瘤細(xì)胞生長抑制過程中發(fā)揮重要作用[4]。

綜上所述，大黃酚對胃癌MKN28細(xì)胞具有誘導(dǎo)其焦亡，從而發(fā)揮增殖抑制作用，其機(jī)制可能與大黃酚激活NLRP3炎癥小體有關(guān)。本研究未來將進(jìn)一步研究大黃酚是否通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而激活NLPR3炎性小體發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖作用，為證實(shí)大黃酚在治療胃癌的潛在價值提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。