陳敏純，閆抗抗，曹 青，谷建俐，鄭 潔，劉生元

（西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院 藥劑科，陜西 西安710018）

缺血性腦卒中嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，其致病率、死亡率居全球首位[1]。缺血是缺血性腦卒中損傷的始動(dòng)因素。“治療性血管新生”成為國(guó)內(nèi)外治療缺血性腦卒中的研究熱點(diǎn)[2]。血管新生為缺血性腦卒中的神經(jīng)發(fā)生、突出再生、神經(jīng)功能恢復(fù)提供氧氣、供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及提供生長(zhǎng)因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α/Nrf2是挽救腦細(xì)胞，恢復(fù)神經(jīng)功能的潛在靶點(diǎn)，PGC-1α/Nrf2通路是參與內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的關(guān)鍵性靶點(diǎn)，其調(diào)控血管新生所累及多種因子表達(dá)[4-5]。臨床以赤芍為主要組成的中藥復(fù)方制劑和中成藥有數(shù)百種（如：補(bǔ)陽(yáng)還五湯、通竅活血湯、步長(zhǎng)腦心通膠囊、腦血栓片等），這些藥物治療缺血性腦卒中應(yīng)用廣泛且療效確切，充分證實(shí)赤芍腦保護(hù)作用。賈所學(xué)在《藥品化義》中記載“紅花為血中氣藥，能瀉又能補(bǔ)，佐赤芍治遍身血?dú)獯掏矗似湫袑?dǎo)而活血也”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明赤芍可改善腦組織線(xiàn)粒體酶活性，緩解腦能量代謝障礙，改善大鼠腦梗死面積，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[6-7]。赤芍對(duì)腦缺血損傷有保護(hù)作用，但其改善腦缺血與促進(jìn)腦血管新生的相關(guān)性及分子作用機(jī)制，鮮有報(bào)道。本研究以大鼠缺血性腦卒中為模型，考察赤芍調(diào)控PGC-1α/Nrf2信號(hào)通路促血管新生作用，為中醫(yī)藥防治缺血性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器、藥品及試劑

Cyto FLEX型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；RM 2016型病理切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；BX53型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；HI650型冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；Multiskan MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛科技公司）；JY-SCZ2+型電泳儀及170-4070轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio Rad公司）。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Roche Applied Science公司，批號(hào)：12156792910）；抗熒光淬滅封片劑（美國(guó)Southern Biotech公司，批號(hào)：0100-01）；DAPI（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C1002）；CD34（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab81289）；PGC-1α抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：66369-1-Ig）；Nrf2抗體（美國(guó)Affinity公司，批號(hào)：AF0639）；VEGF抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：19003-1-AP）；VEGFR-2抗體（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab45010）；赤芍（陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20191201）。

1.2 動(dòng)物

8 ～ 10周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為180 ～ 220 g，購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后才開(kāi)始試驗(yàn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 分組、給藥、造模

分組：將40只大鼠分為空白對(duì)照組、模型組、赤芍低劑量組（200 mg/kg）、赤芍中劑量組（350 mg/kg）、赤芍高劑量組（500 mg/kg），共5組，每組8只。赤芍制劑制備按《標(biāo)準(zhǔn)化煎藥中心基本要求》（SCM02-2018）的制作方法，將赤芍按劑量煎煮制成湯劑，采用噴霧干燥技術(shù)將湯劑制成細(xì)顆粒，用生理鹽水溶解灌胃。給藥劑量基于預(yù)實(shí)驗(yàn)和以往文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[8]赤芍0.5 g/kg。大鼠缺血性腦卒中模型建立：用尼龍線(xiàn)線(xiàn)栓法制備大鼠大腦右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻閉模型，在頸正中切開(kāi)小口，結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈分叉下方剪開(kāi)小口，置入線(xiàn)栓。缺血2 h后拔除線(xiàn)栓?？瞻讓?duì)照組和模型組給予生理鹽水灌胃，給藥組每天給予赤芍一次，連續(xù)灌胃7 d。

2.2 神經(jīng)功能評(píng)分

給藥結(jié)束后，進(jìn)行Garcia評(píng)分，根據(jù)自主運(yùn)動(dòng)情況，碰觸胡須反應(yīng)情況，大鼠懸空狀態(tài)時(shí)四肢活動(dòng)對(duì)稱(chēng)情況，大鼠攀爬能力及抓握鐵網(wǎng)能力，前爪伸展情況，碰觸大鼠身體其感覺(jué)反應(yīng)情況等，按照大鼠反應(yīng)程度進(jìn)行1、2、3分評(píng)定，分?jǐn)?shù)越高，意味著大鼠神經(jīng)功能越完善。

2.3 腦梗死體積檢測(cè)

大鼠神經(jīng)功能評(píng)分后，用水合氯醛（100 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射，取大腦，沿冠狀面進(jìn)行切片，約2 mm厚度，浸泡于2% TTC溶液中，孵育30 min后用10%的多聚甲醛固定2 h，呈現(xiàn)紅色為非梗死區(qū)域，呈現(xiàn)白色為梗死區(qū)域。計(jì)算腦梗死體積。

2.4 腦組織病理學(xué)觀察

大鼠腦組織塊用10%的多聚甲醛固定2 h后，用不同濃度的乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋及切片處理，用蘇木精堿性染料將細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，1%伊紅酸性染液將細(xì)胞質(zhì)染成紅色。照相倍數(shù)為200倍。

2.5 TUNEL凋亡檢測(cè)

大鼠腦組織切片用二甲苯、乙醇、PBS進(jìn)行預(yù)處理，滴加蛋白酶K工作液反應(yīng)30 min，目的是去除組織蛋白。然后加入2% H2O2孵育5 min，用PBS洗滌3次，滴加TdT酶反應(yīng)混合液，于37 ℃中避光孵育1 h，再對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，滴加DAPI避光孵育5 min。熒光顯微鏡下觀察組織切片，呈紅色熒光為凋亡細(xì)胞，呈藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。照相倍數(shù)為400倍。

2.6 大鼠腦微血管密度

將大鼠腦組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟，抗原修復(fù)10 min，加入3% H2O2溶液孵育15 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶，再滴加1∶400 CD34溶液孵育15 h，PBS清洗3次，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠二抗，于37 ℃中孵育20 min后，加入顯色劑顯色，用蘇木素復(fù)染1 min后脫水封片。照相倍數(shù)為400倍。

2.7 腦 組 織 中PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)檢測(cè)

提取腦組織蛋白并對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量計(jì)算。配制電泳膠，用移液槍將制備好的蛋白樣品和MAKER滴加到電泳膠上，各分析樣品總蛋白量為40 μg，在恒壓120 V下進(jìn)行電泳分離后，取出凝膠并切下目的條帶，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，在室溫環(huán)境中的搖床儀器上封閉2 h。將PVDF膜浸泡于一抗孵育液中（一抗稀釋液比例PGC-1α為1∶2 000、Nrf2為1∶500、VEGF為1∶500、VEGFR-2為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，再次將PVDF膜浸泡于HRP標(biāo)記二抗的孵育液中，37℃搖床孵育2 h。顯色曝光，用BandScan分析膠片灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能評(píng)分

空白對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能正常，模型組神經(jīng)功能受損最嚴(yán)重。與空白對(duì)照組比較，模型組評(píng)分降低（P< 0.05），表明模型制備成功。給藥組神經(jīng)功能明顯改善，與模型組比較，赤芍低、中、高劑量組評(píng)分均降低（P< 0.05），且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)表1。

表1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分±s，n = 8）Tab. 1 Effects of paeoniae on neurological sore in model rats±s，n = 8）

表1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分±s，n = 8）Tab. 1 Effects of paeoniae on neurological sore in model rats±s，n = 8）

注：與空白對(duì)照組比較，＃P < 0.05；與模型組比較，*P < 0.05。

組別 神經(jīng)功能評(píng)分空白對(duì)照組 18.00 ± 0.00模型組 6.12 ± 0.35＃赤芍低劑量組 7.75 ± 0.36*赤芍中劑量組 9.75 ± 0.53*赤芍高劑量組 11.50 ± 0.46*F 141.149 P 0.000

3.2 腦梗死體積

空白對(duì)照組大鼠腦組織形態(tài)正常，無(wú)梗死體積，模型組大腦梗死體積最大（37.38 ±1.62）%，而給藥組腦梗死體積與模型組比較，梗死體積變小（P<0.05），且呈劑量依賴(lài)性，高劑量組腦梗死灶最?。?2.26 ± 0.65）%。說(shuō)明赤芍改善缺血性腦卒中大鼠腦神經(jīng)功能，縮小腦梗死灶，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腦梗死體積（n = 8）Fig.1 Effects of paeoniae on cerebral infarct volume in model rats（ n = 8）

3.3 腦組織病理學(xué)變化

HE染色顯示空白對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)基本正常，胞核位于細(xì)胞中央；模型組腦組織疏松，神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，胞核固縮，顏色深染。給藥組的腦組織形態(tài)明顯恢復(fù)，胞核固縮較模型組程度低，神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)消失但大體形態(tài)存在。證實(shí)給藥組腦組織病理學(xué)改善明顯，赤芍對(duì)缺血性腦卒中大鼠有治療作用，見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠腦組織病理學(xué)變化（×200）Fig.2 Effects of paeoniae on the pathological changes in the brain tissue of model rats（ ×200）

3.4 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

空白對(duì)照組無(wú)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，而模型組細(xì)胞凋亡數(shù)量最多（47.58 ± 3.51）%。與模型組比較，給藥組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞降低（P< 0.05），且呈劑量依賴(lài)型，高劑量組細(xì)胞凋亡數(shù)最少（29.32 ± 2.65）%，見(jiàn)圖3。

圖3 赤芍對(duì)模型大鼠抗細(xì)胞凋亡影響（n = 8）Fig.3 Effects of paeoniae on anti-apoptosis in model rats（n = 8）

3.5 大鼠腦血管新生的影響

空白對(duì)照組大鼠腦組織血管豐富，與空白對(duì)照組比較，模型組CD34表達(dá)降低，新生血管減少（P<0.05）；與模型組比較，給藥組CD34表達(dá)水平明顯升高（P< 0.05），且呈劑量依賴(lài)型，見(jiàn)圖4。

圖4 赤芍對(duì)模型大鼠腦組織血管新生的影響（×400）Fig.4 Effects of paeoniae on angiogenesis in the brain tissue of model rats（×400）

3.6 腦 組 織 中PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)蛋白表達(dá)影響

與空白對(duì)照組比較，模型組PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)增加（P< 0.05）；與模型組比較，給藥組PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)明顯增加（P< 0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 赤芍對(duì)模型大鼠PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)影響（n = 8）Fig.5 Effects of paeoniae on the expression of PGC-1α，Nrf2，VEGF and VEGFR-2 in the brain tissue of model rats（n = 8）

4 討論

“治療性血管新生”與中醫(yī)學(xué)的“益氣生脈”“活血生肌”理論密切相關(guān)。缺血性腦卒中可歸為中醫(yī)血瘀證“血脈瘀阻”，而“活血生肌”是中醫(yī)治療腦缺血的主要治法。赤芍有破血行氣、清熱解毒、引血下行之功效。通過(guò)對(duì)中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的用藥規(guī)律統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，單味中藥用藥頻次赤芍位居第六[9]。辨證為氣虛血瘀證、痰濕阻絡(luò)證、風(fēng)痰痹阻證、顱腦水瘀證中，赤芍使用頻率分別為52.01%、48.43%、45.93%、32.65%[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)赤芍改善腦缺血梗死面積，增加SOD、CAT和GSH-Px活性，降低血清MDA和LPO水平；上調(diào)Bax水平和下調(diào)Bcl-2水平，發(fā)揮抗凋亡損傷[11]。前期研究證實(shí)赤芍中的多酚類(lèi)活性物質(zhì)鞣花酸具有血管內(nèi)皮保護(hù)作用，且發(fā)現(xiàn)對(duì)Nrf2有誘導(dǎo)作用[12]。因而推測(cè)，赤芍可激活Nrf2信號(hào)通路促進(jìn)血管新生，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

本研究顯示赤芍縮小腦組織梗死灶，緩解病理?yè)p傷，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，對(duì)缺血性腦卒中大鼠有保護(hù)作用。赤芍是否通過(guò)促血管新生發(fā)揮腦保護(hù)作用，需進(jìn)一步進(jìn)行缺血灶微血管密度及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)水平的檢測(cè)。免疫組化結(jié)果顯示空白對(duì)照組CD34僅有少量黃褐色沉淀。與空白對(duì)照組比較，模型組CD34表達(dá)上升。CD34蛋白是新生血管增殖的標(biāo)志物，在正常情況下為少量表達(dá)，腦缺血后，CD34表達(dá)增多，則提示腦缺血刺激CD34表達(dá)，促血管新生。給藥組高于模型組（P< 0.05），表明赤芍上調(diào)CD34表達(dá)，增加大鼠缺血灶微血管密度。VEGF是一種內(nèi)源性血管生長(zhǎng)因子，在血管生成的各個(gè)階段均發(fā)揮著重要作用[13]。VEGFR-2是VEGF的受體，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，兩者結(jié)合激活血管新生效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)顯示，與模型組比較，給藥組增加腦組織VEGF、VEGFR-2表達(dá)，提示赤芍上調(diào)VEGF、VEGFR-2等細(xì)胞因子表達(dá)，增加缺血周?chē)M織的微血管密度，促進(jìn)缺血區(qū)域循環(huán)的建立。

PGC-1α是調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的重要因子，動(dòng)員VEGF參與新生血管形成，改善神經(jīng)和內(nèi)皮損傷[14]。Nrf2是維持內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和保持血管功能完整性的重要因子[15]。現(xiàn)代研究表明，Nrf2激活可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽生長(zhǎng)，增加深層毛細(xì)血管數(shù)量，在血管新生過(guò)程中發(fā)揮效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組PGC-1α表達(dá)增加（P< 0.05）。此結(jié)果與以往研究結(jié)果一致，研究證明PGC-1α有神經(jīng)保護(hù)作用[16]，腦缺血損傷則上調(diào)PGC-1α表達(dá)，而抑制PGC-1α表達(dá)則加重腦損傷。與模型組比較，給藥組PGC-1α、Nrf2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，提示赤芍促血管新生作用通過(guò)激活PGC-1α/Nrf2信號(hào)通路誘導(dǎo)VEGF/VEGFR-2高表達(dá)。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了赤芍激活PGC-1α/Nrf2信號(hào)通路促血管新生發(fā)揮腦保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。同時(shí)，闡明赤芍“活血生肌”抗缺血性腦卒中的科學(xué)內(nèi)涵，為中醫(yī)藥防治缺血性腦卒中提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)尚需應(yīng)用PGC-1α-/-或Nrf2-/-模式動(dòng)物，驗(yàn)證PGC-1α與Nrf2和VEGF的關(guān)系及促血管新生的作用。