趙麗紅 路亞靜 李忠華
(太原市食品藥品檢驗所 山西太原 030001)
抗真菌藥物為抑制或者殺滅致病真菌的藥物,按其作用特點分為抗淺部真菌藥、抗深部真菌藥、對深部和淺部真菌感染均有效藥物等[1]。治療真菌感染療程較長,療程不足則易復(fù)發(fā)[2];濫用或長期使用抗真菌藥物會產(chǎn)生耐藥性,危害患者身體健康[3-5]。
消字號乳膏為消毒類產(chǎn)品,消毒產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)衛(wèi)生規(guī)范(2009年版)[6]第30條明確列出“消毒產(chǎn)品禁止使用抗生素、抗真菌藥物、激素等物料”。部分不法商家利益至上,為提高產(chǎn)品療效、增加銷量,在此類產(chǎn)品中添加抗真菌藥物,從而造成消費者經(jīng)濟(jì)損失及健康損害。2019年,國外期刊柳葉刀發(fā)表了“消字號”產(chǎn)品中檢出抗真菌藥物的文章[7],國內(nèi)新聞媒體中也常有相關(guān)報道。本文建立了HPLC-MS/MS法測定“消字號”乳膏基質(zhì)中8種常見抗真菌藥物的檢驗方法,并對網(wǎng)絡(luò)平臺及實體店購買的“消字號”乳膏進(jìn)行了測定,為市場監(jiān)管提供技術(shù)參考作用。
三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(島津公司,LCMS 8050);色譜柱:shim-pack XR-ODS 2.0×100 mm,2.2μm;MS105DU電子天平(瑞典梅特勒-托利多公司);XPE304電子天平(瑞典梅特勒-托利多公司);KQ-500DE型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。
甲酸(LC-MS級,日本TCI公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國Merk公司);灰黃霉素、克霉唑、聯(lián)苯芐唑、萘替芬、酮康唑、益康唑等6種標(biāo)準(zhǔn)品購于BePure公司;硝酸咪康唑、鹽酸特比萘芬2種標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院。實驗所用樣品購于網(wǎng)絡(luò)平臺及山西省太原市某些實體店。
標(biāo)準(zhǔn)儲備液:將上述8種標(biāo)準(zhǔn)品分別配置成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18℃避光密封存儲(有效期3個月)。
混合標(biāo)準(zhǔn)儲備中間液:準(zhǔn)確吸取上述2組混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1 mL于100 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,得1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(有效期1周)。
混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確吸取一定體積的上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備中間液于10 mL容量瓶中,乙腈定容,制得0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(臨用現(xiàn)配)。
取0.5 g樣品至50 mL具塞試管中,加入乙腈少量,渦旋震蕩分散,再加入乙腈至35 mL,超聲提取15 min,放冷至室溫,定容。冰浴放置2 h后迅速濾過,即得。
流動相A:0.1%甲酸水溶液;流動相B:0.1%甲酸乙腈溶液.所采用的梯度系統(tǒng)程序如下:0~5.5 mim,20%~65%B;5.5~6.5 mim,65%~95%B;6.5~7.5 mim,95%B;7.5~7.6 mim,95%~20%B;7.6~10 mim,20%B。流速:0.3 mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣體積:1μL。
質(zhì)譜條件:ESI源;霧化氣流量3 L/min;加熱氣流量10L/min;干燥氣流量10 L/min;接口溫度300℃;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。8種抗真菌藥物的保留時間、離子對、碰撞能量等相關(guān)參數(shù)見表1。
表1 8種抗真菌藥物的LC-MS/MS分析參數(shù)
比較了C18和C8 2種色譜柱的分離效果,在相同的流動相條件下,采用C18色譜柱時化合物的分離效果及峰型優(yōu)于C8色譜柱,且C18色譜柱更通用,故選擇C18色譜柱進(jìn)行該項研究。比較了0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動相時化合物出峰情況,后者系統(tǒng)壓力低、峰型好、響應(yīng)高,選其作為該項研究的流動相。
查閱上述8種抗真菌藥的化學(xué)性質(zhì)、含量測定方法后[8-10],初步確定以甲醇、乙腈為提取溶劑進(jìn)行研究。回收率結(jié)果顯示:甲醇為提取溶劑時,灰黃霉素及酮康唑的提取率低且平行樣相對誤差大。研究過程中還發(fā)現(xiàn),部分乳膏基質(zhì)的甲醇或乙腈提取液濾膜過濾后,在室溫較低時,存在基質(zhì)析出的情況,本實驗將處理好的樣品冰浴放置2 h后,促使乳膏基質(zhì)析出,并于溫度未上升時迅速濾過,從而減少了液質(zhì)上機(jī)測試的干擾。
基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect,ME)是UPLC-MS/MS法中影響定量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素[11-13],可采用(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%進(jìn)行評價,正值表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),負(fù)值則表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。|ME(%)|≤20%,認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)弱,可忽略;20%<|ME(%)|≤50%為中等基質(zhì)效應(yīng),|ME(%)|>50%,表明基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)[14]。由表2可知,8種抗真菌藥物在所測試的乳膏中基質(zhì)效應(yīng)均小于20%,以弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)為主,且抗真菌藥物需達(dá)到一定劑量才能發(fā)揮藥效,其添加量一般很大(見表3),至少需稀釋上千倍,而溶劑稀釋可進(jìn)一步減弱LC-MS/MS法中基質(zhì)效應(yīng)[14-15],故本方法中可直接用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。
表3 10批次樣品中8種抗真菌藥物的檢測結(jié)果
配制0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在優(yōu)化好的條件下進(jìn)行上機(jī)測試,以待測抗真菌藥物質(zhì)量濃度(x,ng/mL)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的定量離子對峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:在0.5~50 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),上述8種抗真菌藥物的r值均大于0.99,線性關(guān)系良好。分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算其方法檢出限和定量下限,檢出限為0.03~0.07 mg/kg,定量下限為0.10~0.20 mg/kg,具體數(shù)據(jù)詳見表2。
表2 8種抗真菌藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)
取0.5 g空白基質(zhì)至50 mL具塞試管中,加入混合標(biāo)準(zhǔn)品適量,放至80℃水浴中,待基質(zhì)呈均一液態(tài)時取出,室溫下基質(zhì)自動恢復(fù)半固體狀。加入乙腈適量,渦旋震蕩至分散,再加入乙腈至35 mL,超聲提取15 min,放冷至室溫,定容。冰浴放置2 h后迅速濾過,進(jìn)行精密度、回收率實驗的上機(jī)測試。結(jié)果顯示:8種抗真菌藥物的回收率為89.3%~113.9%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于8%。
將本方法用于網(wǎng)絡(luò)平臺及實體店購買的10批次樣品進(jìn)行分析測試,陽性樣品量值過大時用乙腈稀釋至標(biāo)曲濃度范圍內(nèi)。其中,5批次樣品檢出抗真菌藥物,添加種類及其含量如下表所示。從檢測結(jié)果可知:“消字號”乳膏中存在添加抗真菌藥物的情況,所添加藥物以臨床常用硝酸咪康唑、酮康唑、鹽酸特比萘芬為主,部分產(chǎn)品甚至同時添加3種抗真菌藥物。抗真菌藥物應(yīng)在醫(yī)生、藥師等指導(dǎo)下使用,消費者未感染真菌或不恰當(dāng)使用此類乳膏,會對健康造成損害,應(yīng)引起監(jiān)管部門及消費者重視。
本文建立了“消字號”乳膏中8種抗真菌藥物的檢測方法,采用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀MRM監(jiān)測模式,樣品以乙腈為提取溶劑,渦旋分散后超聲提取15 min,經(jīng)冰浴除雜后進(jìn)行上機(jī)測試。該方法前處理簡單、試劑耗材用量少、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、可同時進(jìn)行定性及定量分析,具有較高的實用價值。