何天富，陳曉藝，吳玉強，羅宇東，陳 清

（1.廣西中醫(yī)藥大學制藥廠，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200）

五指精藍顆粒是根據(jù)壯族民間防治慢性疲勞綜合征的常用藥物篩選而來，由五指毛桃、黃芪、絞股藍、黃精、人參等藥材組成?，F(xiàn)代研究表明，方中多種藥材具有抗衰老、調節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤等作用［1-10］。本課題組擬將五指精藍顆粒研制開發(fā)為用于提高免疫功能的保健食品，前期工作已進行了提取工藝研究［11］，本研究通過對五指精藍顆粒遲發(fā)型變態(tài)反應、血清溶血素測定（體液免疫）、小鼠碳末廓清（小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能）及刀豆蛋白A（ConA）誘導小鼠脾淋巴細胞轉化能力進行實驗研究，探討其對實驗小鼠免疫功能的影響，為五指精藍顆粒的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF級健康成年KM小鼠200只，雌性，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證：SCXK（京）2016-0011。實驗動物室溫度：22～25℃，相對濕度：55～75℃。實驗動物使用許可證：SYXK桂2016-0006。

1.2 藥物 五指精藍顆粒提取稠膏（由廣西中醫(yī)藥大學制藥廠提供，批號：20181001；每克稠膏含生藥材5.2 g，）；復方扶芳藤合劑（廣西中醫(yī)藥大學制藥廠產品，批號：20171201）。

1.3 儀器與試劑 TDL-5-A型離心機（上海安亭科學儀器廠）；全波長全自動多功能酶標儀（美國賽默飛）；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、2-ME（2-巰基乙醇）、青霉素、鏈霉素、ConA、異丙醇、MTT（噻唑藍）、Hank’s液（Hank’s平衡鹽溶液）、PBS緩沖液（磷酸鹽緩沖鹽溶液）、臺酚藍、綿羊紅細胞（SRBC）、生理鹽水、雞紅細胞、SA緩沖液、豚鼠血清、都氏試劑、DNFB（4-二硝基氟苯），以上試劑均為南京建成生物工程研究所產品。

2 方法

2.1 小鼠碳末廓清實驗 取小鼠50只，隨機分為5組：空白對照組、陽性對照組和五指精藍顆粒低、中、高劑量組，每組10只。五指精藍顆粒低、中、高劑量組分別灌胃給予五指精藍顆粒提取稠膏溶液3.9 g/kg、7.8 g/kg、15.6 g/kg（相當于口服推薦用量的5、10、20倍），陽性對照組灌胃給予復方扶芳藤合劑7.5 ml/kg（相當于口服用量的10倍），空白對照組給予等體積的蒸餾水。動物灌胃容積均為20 ml/kg，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d。末次灌胃24 h后，每只小鼠按10 ml/kg尾靜脈注射印度墨汁（以生理鹽水4倍稀釋），于注入墨汁后第2 min、10 min，分別從內眥靜脈叢取血20μl，加入到2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，搖勻。以Na2CO3溶液作空白對照，于600 nm波長測定各管吸光值（OD）。處死小鼠，取肝、脾臟及胸腺，稱重，計算臟器/體重比值和吞噬指數(shù)（a）。a=K1/3×體重/（肝重+脾重），K=（lgOD1－lgOD2）/（t2-t1）。

2.2 血清溶血素實驗 動物分組及給藥同2.1項。末次灌胃24 h后，每鼠腹腔注射2%SRBC懸液0.2 ml，免疫5 d后摘眼球取血，2 000 r/min離心10 min分離血清，取血清用SA緩沖液稀釋200倍，取稀釋后的血清1 ml置試管內，對照管取1 ml SA緩沖液，依次加入10%（V/V）SRBC 0.5 ml、1∶8 SA稀釋的豚鼠血清1 ml。置37℃水浴中孵育20 min后，冰浴終止反應。2 000 r/min離心10 min。取上清液1 ml，加都氏試劑3 ml，另取10%（V/V）SRBC 0.25 ml加都氏試劑至4 ml于另一支試管內，充分混勻，作為半數(shù)溶血值。放置10 min后，于540 nm波長測定各管吸光度值，計算血溶素水平（HC50）。HC50=樣品OD/SRBC半數(shù)溶血時的OD×稀釋倍數(shù)。

2.3 遲發(fā)型超敏反應（DTH）實驗 動物分組及給藥同2.1項。末次給藥24 h后，用硫化鋇將小鼠腹部皮膚脫毛約3 cm×3 cm范圍，涂以1%DNFB溶液（丙酮∶麻油=1∶1）50μl致敏，5 d后將10μl DNFB均勻涂抹于小鼠右耳兩面，24 h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳廓，用打孔器取下8 mm直徑的耳片、稱重，以左右耳重量之差值表示DTH的程度。

2.4 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗（MTT法）動物分組及給藥同2.1項。末次給藥后處死小鼠，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，制成細胞懸液，經200目篩網過濾。用Hank’s液洗2次，每次離心10 min（1 000 r/min）。然后將細胞懸浮于1 ml完全培養(yǎng)液中，計數(shù)活細胞數(shù)，用RPMI 1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為3×106個/ml。再將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml，在其中一孔加75μl ConA液（相當于7.5μg/ml），另一孔作為對照，置5%CO2，37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 ml，加入0.7 ml不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時加入MTT（5 mg/ml）50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入1 ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔作3個平行孔，用酶標儀于570 nm波長測定光密度值。淋巴細胞的增殖能力=加ConA孔的光密度值-不加ConA孔的光密度值。

2.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間差異采用方差分析。P<0.05為差異有顯著性意義。

3 結 果

3.1 五指精藍顆粒對小鼠體質量的影響 見表1。與空白對照組比較，五指精藍顆粒各劑量組和陽性對照組對小鼠體質量增長的影響無顯著性差異（P>0.05），提示五指精藍顆粒對小鼠的體質量增長無明顯影響。

表1 五指精藍顆粒對小鼠體質量的影響 （g，±s）

表1 五指精藍顆粒對小鼠體質量的影響 （g，±s）

組 別空白對照組陽性對照組五指精藍顆粒低劑量組五指精藍顆粒中劑量組五指精藍顆粒高劑量組n 10 10 10 10 10初始體重21.16±0.82 20.27±1.06 21.82±0.61 21.96±0.70 21.30±0.66末期體重35.24±2.25 33.21±2.94 34.26±2.86 35.35±2.89 35.24±1.74增重14.08±1.71images/BZ_75_1657_1321_1657_1326.png12.94±1.08 12.44±0.92 13.39±1.01 13.94±1.23

3.2 五指精藍顆粒對小鼠臟器/體重比值的影響 見表2。與空白對照組比較，五指精藍顆粒各劑量組和陽性對照組小鼠的胸腺/體重及脾臟/體重比值無顯著性差異（P>0.05），提示五指精藍顆粒對小鼠免疫器官的重量無明顯影響。

表2 五指精藍顆粒對小鼠臟器/體重比值的影響（%，±s）

表2 五指精藍顆粒對小鼠臟器/體重比值的影響（%，±s）

組 別空白對照組陽性對照組五指精藍顆粒低劑量組五指精藍顆粒中劑量組五指精藍顆粒高劑量組n 10 10 10 10 10胸腺/體重0.47±0.15 0.49±0.09 0.43±0.08 0.46±0.07 0.49±0.06脾臟/體重0.44±0.18 0.54±0.16 0.42±0.11 0.41±0.07 0.49±0.15

3.3 五指精藍顆粒對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響 見表3。與空白對照組比較，陽性對照組、五指精藍顆粒高劑量組的吞噬指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示五指精藍顆粒能有效提高小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能。

表3 五指精藍顆粒對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響 （±s）

表3 五指精藍顆粒對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響 （±s）

注：與空白對照組比較，①P<0.05

組 別空白對照組陽性對照組五指精藍顆粒低劑量組五指精藍顆粒中劑量組五指精藍顆粒高劑量組n 10 10 10 10 10吞噬指數(shù)3.32±1.04 4.38±0.77①3.18±0.80 2.88±0.47 4.65±0.70①

3.4 五指精藍顆粒對小鼠體液免疫的影響 見表4。與空白對照組比較，陽性對照組和五指精藍顆粒高劑量組的血清溶血素水平（HC50值）顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），提示五指精藍顆粒能有效提高小鼠血清溶血素水平。

表4 五指精藍顆粒對小鼠血清溶血素的影響（±s）

表4 五指精藍顆粒對小鼠血清溶血素的影響（±s）

注：與空白對照組比較，①P<0.05，②P<0.01

組 別空白對照組陽性對照組五指精藍顆粒低劑量組五指精藍顆粒中劑量組五指精藍顆粒高劑量組n 10 10 10 10 10 HC50 88.79±2.87 92.69±2.37①89.15±3.95 88.96±3.75 95.56±0.74②

3.5 五指精藍顆粒對小鼠細胞免疫的影響 見表5。與空白對照組比較，陽性對照組、五指精藍顆粒高劑量組小鼠左右耳片重量差值顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.05），提示五指精藍顆粒對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應有明顯影響。

表5 五指精藍顆粒對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響（mg，±s）

表5 五指精藍顆粒對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響（mg，±s）

注：與空白對照組比較，①P<0.01，②P<0.05

組 別空白對照組陽性對照組五指精藍顆粒低劑量組五指精藍顆粒中劑量組五指精藍顆粒高劑量組n 10 10 10 10 10左右耳片重量差值1.14±0.88 2.98±1.12①1.41±0.89 1.29±0.75 2.31±0.83②

3.6 五指精藍顆粒對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化能力的影響 見表6。與空白對照組比較，陽性對照組和五指精藍顆粒高劑量組小鼠的淋巴細胞轉化能力明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），提示五指精藍顆粒能有效提高小鼠淋巴細胞轉化能力。

表6 五指精藍顆粒對小鼠淋巴細胞轉化能力的影響（±s）

表6 五指精藍顆粒對小鼠淋巴細胞轉化能力的影響（±s）

注：與空白對照組比較，①P<0.01，②P<0.05

組 別空白對照組陽性對照組五指精藍顆粒低劑量組五指精藍顆粒中劑量組五指精藍顆粒高劑量組n 10 10 10 10 10淋巴細胞增殖能力（OD值）0.192±0.004 0.220±0.004①0.191±0.012 0.197±0.010 0.218±0.007②

4 討論

本研究按《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》對五指精藍顆粒分別進行了遲發(fā)型變態(tài)反應、血清溶血素測定、小鼠碳末廓清及ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化能力實驗。實驗結果表明，五指精藍顆粒對小鼠的體重增長、臟器系數(shù)（胸腺、脾臟）等無明顯影響，表明五指精藍顆粒對小鼠免疫器官無影響。單核-巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調節(jié)等重要作用，其吞噬機能是反映機體非特異性免疫功能的主要指標之一［12］。實驗結果表明，五指精藍顆粒高劑量組的吞噬指數(shù)高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義，表明五指精藍顆?？捎行岣邌魏?巨噬細胞的吞噬功能。血清溶血素能反應機體的體液免疫［13］，五指精藍顆粒高劑量組血清溶血素水平（HC50值）顯著提高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義，提示五指精藍顆粒對體液免疫有明顯的促進作用。五指精藍顆粒高劑量組小鼠左右耳片重量差值及淋巴細胞轉化能力均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明五指精藍顆粒對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應有明顯影響，可有效提高小鼠的淋巴細胞轉化能力。

綜上所述，五指精藍顆粒對小鼠體液免疫、單核-巨噬細胞功能、細胞免疫功能均有一定增強作用。